基于免疫磁分离的荧光微球免疫层析法检测猪霍乱沙门氏菌

发布时间：2019-09-21 10:03

【摘要】：建立了基于免疫磁分离的荧光微球免疫层析法,检测猪霍乱沙门氏菌。待检样品经免疫磁分离富集和热洗脱处理后,用荧光微球免疫层析试纸条进行检测。每毫克纳米磁珠标记30μg抗体制备的免疫磁珠,对浓度为10~2~10~6CFU/mL的猪霍乱沙门氏菌的捕获率均大于90%,特异性好;在pH=6时,以300μg/mg猪霍乱沙门氏菌单抗11D8-D4标记荧光微球,制备免疫荧光微球;以2.0 mg/mL猪霍乱沙门氏菌单抗5F11-B11喷涂检测线(T线),以1.0 mg/mL驴抗鼠IgG喷涂质控线(C线),制备免疫层析试纸条。采用建立的基于免疫磁分离的荧光微球免疫层析方法检测猪霍乱沙门氏菌,在PBS缓冲液中检出限为1.5×10~5CFU/mL,牛奶中检出限为7.6×10~5CFU/mL,与直接采用荧光微球免疫层析方法检测相比,检出限分别降低了10倍和200倍。本方法可有效富集牛奶中的沙门氏菌,避免了基质干扰,灵敏度大大提高,具有较好的应用前景。
【图文】：

10010Amountoflabelingantibody（mg/mg）CE（%）80604020020304050A100Amountofimmunomagneticbeads（mg/mL）CE（%）80604020052050100200B100ConcentrationofS.choleraesuis（CFU/mL）CE（%）806040200C2.1×1062.1×1052.1×1042.1×1032.1×102图1(A)不同抗体标记量时的捕获率;(B)不同IMBs用量时的捕获率;(C)对不同浓度猪霍乱沙门氏菌的捕获率Fig．1Captureefficiency(CE)ofimmunomagneticbeads(IMBs)underdifferentconditions:(A)CEwithdifferentamountoflabelingantibody，(B)CEwithdifferentamountofIMBs，and(C)CEwithdifferentcon-centrationsofS．choleraesuis3．4IFMs标记条件的优化3．4．1IFMs标记pH值的优化pH值对荧光微球的标记影响很大，会影响抗体表面可供偶联的活性基团的数量和其暴露程度，从而影响偶联率，也可能影响抗体和荧光微球的结合方式，从而影响IFMs的活性［25］。如表1所示，当pH=6时，偶联率最高。检测1．52×107CFU/mL的目标菌时，T线的信号值最大。检测1．9×106CFU/mL目标菌时，只有pH=6的条件对应试纸条T线出现信号。因此，最佳标记条件选择pH6。表1免疫荧光微球标记pH值的优化*Table1OptimizationofpHforpreparationofimmunofluorescentmicrospheres(IFMs)(n=3)*pH抗体偶联率Conjugatingrate(CＲ，%)荧光微球上偶联的抗体AmountofantibodyconjugatedtoIFMs(μg)T线荧光信号值FluorescencesignalofTline(a．u．)1．52×107CFU/mL1．90×106CFU/mL565．5196．5104．7±12．2－677．7233．1295．9±21．864．1±2．2772．3216．9138．9±4．8－870．6211．8113

7.60×1040FM鄄LFA0.01.52×1057.60×1051.52×1063.80×1067.60×1061.52×1067.60×1040.01.52×1057.60×1051.52×1063.80×1067.60×1061.52×1071.52×1083.14×108CFluorescent%signalof%T%line%（a.u.）图2FM-LFA和基于IMS的FM-LFA检测灵敏度的比较。(A)检测PBS基质中的猪霍乱沙门氏菌;(B)检测牛奶中的猪霍乱沙门氏菌;(C)基于IMS的FM-LFA检测牛奶中的猪霍乱沙门氏菌Fig．2Comparisonofsensitivitybetweenfluorescentmicrosphere(FM)-lateralflowassay(LFA)andFM-LFAbasedonimmunomagneticseparation(IMS):(A)detectionofS．choleraesuisinPBSbyFM-LFAandFM-LFAbasedonIMS;(B)detectionofS．choleraesuisinmilkbyFM-LFAandFM-LFAbasedonIMS;(C)stripsimageofFM-LFAbasedonIMSfordetectionofS．choleraesuisinmilkＲeferences1MaurischatS，BaumannB，MartinA，MalornyB．Int．J．FoodMicrobiol．，2015，193:8－142IwabuchiE，MaruyamaN，HaraA，NishimuraM，MuramatsuM，OchiaiT，HiraiK．J．FoodProtect．，2010，73(11):1993－20003MüllerL，Kjels錙C，FrankC，JensenT，TorpdahlM，S錙borgB，DorleansF，，ＲabschW，PragerＲ，GossnerC．M，Ethel-bergS．Epidemiol．Infect．，2016，144(13):2802－28114WangJY，ChenMH，ShengZC，LiuDF，WuSS，LaiWH．ＲSCAdv．，2015，5(76):62300－623055ZhangZ，XiaoL，LouY，JinM，LiaoC
【作者单位】： 南昌大学食品科学与技术国家重点实验室;江西省林业科学院;江西省疾病预防控制中心;
【基金】：国家自然科学基金(No.31271863) 江西省教育厅落地项目(No.KJLD13009) 江西省生猪产业质量安全岗位专家项目(No.JXARS-03)资助~~
【分类号】：R446.6

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本文编号：2539297