阪崎克罗诺杆菌免疫检测技术的建立

发布时间：2019-09-24 22:03

【摘要】：阪崎克罗诺杆菌是一类条件致病菌。其危害的人群为新生儿、婴幼儿及老年人,由该菌引发的症状包括小肠结肠炎、败血症、脑膜炎和菌血症,具有较高的致死率。因此,建立快速灵敏的检测方法对于该菌的预防与控制具有重要的意义。本研究基于8株阪崎克罗诺杆菌(CICC22922, CICC21560, 90905, ATCC29004,ENS6607,ATCC12868,ENS70307-2, ENS07208)已经鉴定出来的 59 个具有免疫反应的蛋白质点,筛选出特异性较高的2个外膜蛋白点。将最终筛选出来的这两个特异性蛋白,结合该蛋白三维结构,找出特异性强的膜外氨基酸序列并找到编码它们的核苷酸序列,分别为基因A和基因B,长度分别为138 bp、132 bp。通过PCR验证其属内覆盖性和属外特异性。由于基因片段太短因此通过柔性肽将两段特异性基因片段重复连接,序列经公司合成后连接到载体PUC57,通过双酶切构建pET-26b(+)重组表达质粒。在大肠杆菌BL21中进行了重组蛋白的诱导及表达优化,获得分子量约为22 kDa的融合蛋白A和分子量约为20 kDa的融合蛋白B。将2种重组蛋白进行大规模重组表达并亲和纯化获得了目的蛋白后,分别免疫新西兰白兔和SPF鸡,制备多克隆抗体。利用纯化的鸡源多抗(IgY)和兔源多抗(IgG)对阪崎克罗诺标准菌株进行双抗夹心ELISA检测。初步建立并优化了双抗夹心ELISA法:以蛋白A鸡源多抗(A-IgY)为捕获抗体,包被量为0.5μg,蛋白A兔源多抗(A-IgG)为检测抗体,抗体稀释倍数为200倍,封闭液为溶于PBS的1%的脱脂乳粉,酶标二抗稀释倍数为20000倍。对建立的双抗夹心ELISA方法进行评价,检测限为1.5×107 CFU/mL,定量限为3.9×107 CFU/mL。板内变异为1.69%-4.62%,板间变异为4.12%-7.4%。用此方法检测3株不同的阪崎克罗诺杆菌、5株不同种的克罗诺杆菌和6株非克罗诺杆菌属的菌株,结果表明该检测方法对克罗诺杆菌具有较好的特异性。
【图文】：

证明Ａ特异性基因在中的覆盖率较高。在３０株Ｃ．逡逑菌株中利用ＰＣＲ验证基因Ｂ的特异性，结果显示只有＃３０号（ＥＮＳ５３２９）、＃３２号逡逑（ＥＮＳ５１０２４－２）菌株中没有出现特异性条带（图３－２），其余菌株中均扩出了邋Ｂ特异性基因逡逑片段，证明Ｂ特异性基因片段在中的覆盖率也较高。逡逑Ｍ邋０１２邋３邋６＂９邋Ｖｉｓｉｏｎ邋２６２８邋３０邋３２３３３５邋３６３７３Ｓ３９４０邋４１４２４３４６邋４？邋４Ｓ４９５０邋３１邋５２逡逑逦ＨＩＭ）逦＾邋＾邋－邋．邋．邋邋邋＊邋…、－■．ｗ。、＇．ａ．邋…．逡逑！ｇ逡逑图３－１邋ＰＣＲ验证Ａ基因在阪崎克罗诺杆菌中的覆盖性逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋３－１邋Ｔｈｅ邋ｃｏｖｅｒａｇｅ邋ｏｆ邋Ｇｅｎｅ－Ａ邋ｉｎ邋ｃｒｏｎｂａｃｔｅｒ邋ｓａｋａｚａｋｉｉ邋ｖｅｒｉｆｉｅｄ邋ｂｙ邋ＰＣＲ逡逑Ｍ．邋ＤＮＡ标准ＤＬ２０００；０．空白对照；１－５２．实验室菌株编号逡逑Ｍ．邋ＤＮＡ邋Ｍａｒｋｅｒ邋ＤＬ２０００；邋Ｏ．邋Ｎｅｇａｔｉｖｅ邋ｃｏｎｔｒｏｌ；邋１－５２．邋Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ邋ｓｔｒａｉｎｓ邋ｎｕｍｂｅｒ逡逑ＭＯｌ邋２３邋６邋’邋９邋ｒｉＳ２０邋２２邋２６邋２８３０３２３３邋３￥邋３６３７邋３Ｓ３９４０４１４２邋４３邋４６４￣

证明Ａ特异性基因在中的覆盖率较高。在３０株Ｃ．逡逑菌株中利用ＰＣＲ验证基因Ｂ的特异性，结果显示只有＃３０号（ＥＮＳ５３２９）、＃３２号逡逑（ＥＮＳ５１０２４－２）菌株中没有出现特异性条带（图３－２），其余菌株中均扩出了邋Ｂ特异性基因逡逑片段，证明Ｂ特异性基因片段在中的覆盖率也较高。逡逑Ｍ邋０１２邋３邋６＂９邋Ｖｉｓｉｏｎ邋２６２８邋３０邋３２３３３５邋３６３７３Ｓ３９４０邋４１４２４３４６邋４？邋４Ｓ４９５０邋３１邋５２逡逑逦ＨＩＭ）逦＾邋＾邋－邋．邋．邋邋邋＊邋…、－■．ｗ。、＇．ａ．邋…．逡逑！ｇ逡逑图３－１邋ＰＣＲ验证Ａ基因在阪崎克罗诺杆菌中的覆盖性逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋３－１邋Ｔｈｅ邋ｃｏｖｅｒａｇｅ邋ｏｆ邋Ｇｅｎｅ－Ａ邋ｉｎ邋ｃｒｏｎｂａｃｔｅｒ邋ｓａｋａｚａｋｉｉ邋ｖｅｒｉｆｉｅｄ邋ｂｙ邋ＰＣＲ逡逑Ｍ．邋ＤＮＡ标准ＤＬ２０００；０．空白对照；１－５２．实验室菌株编号逡逑Ｍ．邋ＤＮＡ邋Ｍａｒｋｅｒ邋ＤＬ２０００；邋Ｏ．邋Ｎｅｇａｔｉｖｅ邋ｃｏｎｔｒｏｌ；邋１－５２．邋Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ邋ｓｔｒａｉｎｓ邋ｎｕｍｂｅｒ逡逑ＭＯｌ邋２３邋６邋’邋９邋ｒｉＳ２０邋２２邋２６邋２８３０３２３３邋３￥邋３６３７邋３Ｓ３９４０４１４２邋４３邋４６４￣
【学位授予单位】：天津科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R446.6

【参考文献】

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本文编号：2541073