胆固醇代谢与造血干细胞的增殖分化和短时高温致红细胞损伤的探讨

发布时间：2019-10-08 21:41

【摘要】：本论文由两部分组成,第一部分是细胞胆固醇代谢与造血干细胞的增殖分化研究,第二部分是短时高温致红细胞损伤的机制研究。第一部分:目的通过pLKO.1-NPC1/NPC2 shRNA重组慢病毒感染EML(erythroid myeloid lymphoid,EML)细胞获得NPC1、NPC2基因沉默的EML细胞模型,进而探讨NPC1、NPC2对EML细胞增殖分化的影响。方法通过NPC1 shRNA、NPC2 shRNA重组慢病毒感染EML细胞获得NPC1、NPC2基因有效沉默的EML细胞模型。利用该模型以Filipin染色检测NPC1、NPC2基因敲低后对EML细胞内胆固醇分布的影响,以CCK-8和台盼蓝染色进行增殖检测,以流式细胞术检测NPC1、NPC2基因沉默后EML细胞干性标志物CD34、sca-1、c-kit及TER-119、CD11b、B220的改变,利用Western blot分析SCF刺激细胞后c-kit磷酸化的改变。结果成功构建NPC1、NPC2基因沉默的EML细胞模型,NPC1、NPC2基因在mRNA和蛋白水平表达均显著降低(P0.01)。NPC1、NPC2敲低的EML细胞中出现胆固醇蓄积,且在NPC1敲低的EML细胞模型中胆固醇蓄积更显著。沉默NPC1、NPC2基因后使得EML细胞增殖减慢(P0.01),并且能够降低EML细胞CD34、sca-1和TER-119、B220的阳性率(P0.01)。经SCF刺激后NPC1基因沉默的EML细胞中c-kit的磷酸化降低显著(P0.01),但在NPC2基因沉默的EML细胞中c-kit磷酸化的改变并无统计学差异。结论胆固醇转运相关基因NPC1通过调节细胞胆固醇流动参与了EML细胞的增殖和分化调控。造血干细胞(hematopoietic stem cells,HSCs)是机体具有组织特异性的一群细胞,为了维持正常的造血功能其可通过不对称分裂(asymmetric division)在调节自身数量稳定的同时生成多系和/或单系造血祖细胞(hematopoietic progenitor cells,HPCs)。正常生理情况时,机体HSCs的含量和各系造血祖细胞的数量维持在一个动态平衡的状态。当这个稳定平衡状态被打破,HSCs的量急剧增多或哪一系或多系造血祖细胞数量发生显著改变都将引发疾病。究其机制,过去大量的研究主要聚焦在免疫系统。近年来,有研究显示细胞内胆固醇的流出对HSCs和HPCs稳态维持起着重要作用。三磷酸腺苷结合蛋白ABCA1和ABCG1通过把HSCs和HPCs内胆固醇转运至高密度脂蛋白(high-density lipoprotein,HDL)而将其运出细胞,当ABCA1和ABCG1缺失时上述胆固醇转运途径障碍,将使得造血祖细胞恢复造血功能,同时出现髓外造血。此外,巨核细胞祖细胞(megakaryocyte progenitor cells,MPCs)内胆固醇外流障碍将引发血小板增多综合征,与ABCG1高度同源的三磷酸腺苷结合转运蛋白ABCG4在巨核细胞祖细胞中的缺失将使得胞内胆固醇转运至HDL障碍,进而引发细胞膜促血小板生成素(thrombopoietin,TPO)受体(c-MPL)表达增多,最终引发疾病。在动脉粥样硬化的小鼠在体模型中载脂蛋白E(apo lipoprotein E,ApoE)通过影响ABCA1和ABCG1的功能而调节细胞内胆固醇流出进而调控HSCs增殖且与单核细胞增多相关。除此之外,NPC1、NPC2基因在胆固醇流出细胞的过程中同样起着关键作用。NPC1基因的缺失将引发以胆固醇转运障碍为特征的尼曼匹克病(NPC1),患者主要表现为神经元的大量胆固醇聚集和神经功能障碍,同时患者也存在造血功能障碍,但是机制不清楚,还需要探讨。为了探索NPC1、NPC2基因调节造血干细胞生物学特性,特别是增殖和分化特征,本课题以造血干细胞系EML(erythroid myeloid lymphoid)作为模型,通过基因表达分析、基因功能分析研究NPC1、NPC2基因对EML细胞增殖和分化的调控及其机制。首先我们根据EML细胞干性标志sca-1不同水平的表达,通过细胞流式技术分离sca-1-high、sca-1-inter、sca-1-low 3个细胞亚群,检测各亚群细胞中NPC1和NPC2基因的表达,分析NPC1、NPC2基因表达与EML细胞干性的关联。其次,通过基因沉默技术敲降(knock-down)EML细胞NPC1和NPC2基因,分析NPC1和NPC2对EML细胞增殖和分化的影响。最后,通过分析NPC1和NPC2基因对SCF介导c-kit磷酸化的影响,探讨NPC1和NPC2调节细胞增殖分化的机制。本研究得到的主要结果有:在EML细胞中NPC1和NPC2基因的表达与sca-1呈正相关。利用NPC1、NPC2基因慢病毒成功构建了NPC1、NPC2基因敲低的EML细胞模型。Filipin染色结果显示,与对照相比,在NPC1和NPC2基因沉默的EML细胞中胆固醇显著蓄积,且NPC1基因沉默的EML细胞中胆固醇蓄积更显著。NPC1、NPC2基因沉默的EML细胞生长明显慢于对照细胞(P0.01),表明NPC1和NPC2基因参与了EML细胞的增殖调控。同时,NPC1、NPC2基因沉默的EML细胞CD34和sca-1的阳性率显著降低(P0.01),提示NPC1、NPC2沉默以后能够使EML细胞的分化能力降低。在几种细胞中粒系标志物CD11b所占比例均较低,且差异无统计学意义,说明NPC1、NPC2基因敲低后对EML细胞向粒系的分化并无影响;而在NPC1沉默的EML细胞中TER-119所占比例显著低于其余3种细胞(P0.01),说明NPC1基因的沉默能够抑制EML细胞向红系分化;B220所占比例在NPC1、NPC2基因沉默的EML细胞中显著降低(P0.01),表明沉默NPC1、NPC2基因能够抑制EML细胞向淋巴系分化。SCF刺激细胞后,NPC1基因沉默的EML细胞c-kit磷酸化受到明显抑制(P0.01),但在NPC2基因沉默的EML细胞中c-kit的磷酸化改变并无统计学差异。提示,NPC1基因参与了EML细胞c-kit的磷酸化调控。利用细胞胆固醇转运阻断剂U18666A、细胞膜胆固醇剥离剂beta-CD、游离胆固醇处理EML细胞后发现,经U18666A、beta-CD处理后EML细胞c-kit的磷酸化显著降低(P0.01),与NPC1基因沉默对c-kit磷酸化的影响一致;并且,当联合使用beta-CD和胆固醇处理后相较于前者,EML细胞c-kit的磷酸化有所升高(P0.01),提示NPC1对SCF介导的EML细胞c-kit磷酸化的影响是通过改变细胞膜胆固醇含量实现的。第二部分:红细胞(Red blood cells,RBC)是哺乳动物血液中数量最多的血细胞,RBCs除了是氧气运输的主要媒介还是重要的免疫细胞。RBCs生成于骨髓,在体内,新生的RBCs平均寿命为120d,并将经历轻龄、中龄、老龄3个阶段,最终衰老的RBCs被机体免疫系统清除,或是在经过肝脏时被枯否细胞(Kupffer Cells)分解为胆汁。但在病理状态下RBCs的衰老死亡将加剧。细胞生物学研究发现,高温能够引起细胞质膜变形,形成凸起状泡。在一定程度上,泡的形成是自适应的,从而增加细胞的存活率。但是细胞受热越严重起泡程度越大,并且细胞死亡率越高。广泛的数据显示,高热、热射病时体温升高治疗不及时或治疗不完善将导致红细胞减少甚至贫血,但究其机制还尚不清楚,亟待进一步研究。为了观察短时高温引起红细胞结构和功能的变化,探讨高热(中暑)引起红细胞损伤的机制。本研究取健康志愿者的静脉血,分别在37℃(对照组)和42℃(实验组)下孵育10 min,Percoll密度梯度离心法分离不同细胞年龄的红细胞,测定其Zeta电位值,分析不同年龄红细胞所占比例的改变;同时,我们利用流式细胞仪检测细胞大小、细胞凋亡以及红细胞内活性氧(ROS)的变化,探讨高温对红细胞衰老、凋亡的影响。本研究得到的主要结果有:与37℃相比,42℃下实验组的红细胞表面电荷显著降低(P0.05),红细胞体积显著减小(P0.05),凋亡显著增加(P0.05),细胞内ROS显著增加(P0.05)。最终发现,短时高温能引起红细胞理化性质的改变,进而导致红细胞衰老、凋亡加剧,这可能是急性高热(中暑)引起血液系统病理改变的机制。
【图文】：

比较图,相关性分析,细胞,胆固醇

19A-B: 流式分选 EML 细胞 sca-1-high、sca-1-inter、sca-1-low 各亚细胞群；C-D:q-PCR 检测 EML细胞 sca-1-high、sca-1-inter、sca-1-low 亚细胞群基因 NPC1、NPC2 的表达，1：EML/sca-1-high，2：EML/sca-1-inter，3：EML/sca-1-low;；a：P＜0.01，，与 sca-1-high, sca-1-inter 比较图 1 EML 细胞 NPC1、NPC2 基因的表达与 sca-1 的相关性分析2.5 讨论NPC1、NPC2 基因编码的蛋白主要分布于细胞溶酶体，在细胞内胆固醇转运过程中起着重要作用。NPC1 和可溶性胆固醇结合蛋白 NPC2 共同作用，将细胞摄取和合成的胆固醇从 LE/Ly 转运到内质网、胞浆膜和其他细胞器膜[6]。其中分布于细胞膜的胆固醇是构成细胞膜脂质筏的主要成分，能够维持脂质筏结构和功能的完整。脂质筏是细胞膜上含有众多信号分子的微区，介导了多条信号通路的转

基因沉默,细胞,半定量分析,表达水平

34细胞 NPC1 和 NPC2 基因的表达 a:P＜0.01, 与各细胞NPC1和NPC2基因编码蛋白的表达水平：EML/NPC2shRNA；C：半定量分析 n=3, a:P＜图 3 NPC1 和 NPC2 基因沉默的 EML 细胞验证
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R457.7

【参考文献】