基于编码磁性微粒的病原微生物快速高通量检测技术研究

发布时间：2019-11-12 10:47

【摘要】：为了适应临床病原微生物检测需求,保障国家公共卫生安全,提高人民健康水平,建立能对病原微生物特征信息进行快速、多靶点检测且适用于自动化平台的分子诊断新技术十分必要,具有非常重要的实用价值和社会意义。致泻性大肠埃希氏菌在腹泻菌中占有很大比例,主要是通过污染的食物和水传播,我国检出率较高的地区主要在山东、福建、河南。传统的检测方法主要是以培养为基础的形态学检测和生化检测,这种方法操作繁琐、检测时间长,难以满足临床检测要求。随着分子生物学的发展,以核酸为基础的检测方法越来越多的应用到病原微生物的检测,但大多方法普遍难以实现高通量自动化检测。本研究旨在结合多重PCR和编码磁性微粒的优势,以大肠埃希氏菌(E.coli)、肠侵袭性大肠埃希氏菌(enteroinvasive E.colic,EIEC)、肠致病性大肠埃希氏菌(enteropathogenic E.colic,EPEC)、肠产毒性大肠埃希氏菌(enterotoxigenic E.coli,ETEC)、出血性大肠埃希氏菌(enterohaemorrhagic E.coli,EHEC)为检测靶标,建立了一种新型、快速、高通量且易于实现自动化检测的方法,从而能够快速、准确、高效地检测病原微生物。本研究的主要内容包括以下几个方面:第一,多重PCR反应体系的构建。以肠侵袭性大肠埃希氏菌、肠致病性大肠埃希氏菌、肠产毒性大肠埃希氏菌、出血性大肠埃希氏菌为检测目标设计了8对特异性引物和一对通用引物。对多重PCR中第一步PCR中的第一阶段,即基因特异性引物扩增阶段的循环数进行了优化,确定12循环效果更好。调试了特异性扩增阶段混合引物中各引物的工作浓度,最后确定uid A、ipaH、stx2、stx1、eae、rfbe、ST、LT的最佳工作浓度分别为0.2μM、0.2μM、0.2μM、0.2μM、0.4μM、0.4μM、0.4μM、0.8μM。第二,多重PCR结合基因芯片检测方法的研究。针对4种致泻性大肠埃希氏菌的靶基因设计了对应的捕获探针序列、对照探针序列以及阳性对照组的互补序列。通过多重PCR和基因芯片技术联用,建立了基因芯片检测方法。确定了EHEC、ETEC、EPEC、EIEC、E.coli的检测灵敏度分别为1.3×104 CFU/mL、2×105 CFU/mL、4×104 CFU/mL、7.2×104 CFU/mL、1.7 CFU/mL。第三,用构建的多重PCR结合编码磁性微粒芯片的检测方法研究。应用编码磁性微粒芯片检测5种大肠埃希氏菌,检测特异性好,EHEC、ETEC、EPEC、EIEC、E.coli的检测灵敏度可达1.3×104 CFU/mL、2×104 CFU/mL、4×104 CFU/mL、7.2×104 CFU/mL、1.7 CFU/mL。编码磁性微粒芯片的单个菌株检测结果与基因芯片结果相近,但对于菌株中的单个靶分子,大多数编码磁性微粒芯片的检测灵敏度更高。
【图文】：

实物,高通量

硕士毕业论文码磁性微粒及其在生物检测中的应用码磁性微粒的特点码磁性颗粒(Barcoded Magnetic Beads, BMBs) 是由 Winston Ho 等在 2012 年 4 月正式发布成为商品，属于美国 AppliedBioCode 公司分别为 70-100 μm、25 μm、6 μm；由顺磁性生物相容高分子复合组装构成，不仅生物相容性好而且分子长期稳定，易于磁分离；工艺，，条形码制备成本低，且条码易被准确扫描，共有 4096 个可用 4095，从而可以同时检测 4096 个不同的靶分子，实现高通量检发了 BMB 分析系统：BioCode MD×3000（见图 1-1）、BioCodee1000A 可以实现高通量检测。

示意图,工作原理,示意图,细胞因子

图 1-2 编码磁性微粒工作原理示意图(a) 基于核酸杂交的检测原理；(b) 基于抗原抗体结合的检测原理基于 BMB 的检测方法易实现高通量检测、信号稳定、检测设备简单且能够实现自动化检测。近年来 BMB 受到了广泛的关注，Zhang 等[60]用编码磁性微粒技术检测出了人血清中的 30 个细胞因子，检出限小于 5 pg/mL，细胞因子间和同一细胞因子内 CV 均小于 10%，与传统的酶联免疫吸附实验结果有很好的相关性。Casen等[61]采用编码磁性微粒技术检测肠道菌群，针对 300 种细菌设计了 54个探针，通过与 165 例健康者细菌普相比，发现 73%的肠易激综合征(IrritableBowel Syndrome, IBS) 肠道菌群微生态失调，且深度测序与实验结果高度相关。除此之外，据一些会议海报和新闻报道也有一些科研团队开始使用编码磁性微粒技术来进行各种研究，如 AppliedBioCode 公司从 2014 年一直致力于肠道微生物的检测，2016 年用高通量 BioCode MD×3000 系统同时检测 18 种肠道微生物，检测限为 102至 105CFU/mL。台湾 Sandra Lee 等人用编码磁性微粒技术实现了HPV(Human Papillomavirus) 的 50 种分型。Cheryl Sesler 等人用这种技术结合
【学位授予单位】：湖南工业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R446.5

【参考文献】