伤寒沙门菌Mig-14抵抗多粘菌素B杀伤机制研究

发布时间：2020-02-27 00:03

【摘要】：目的:mig-14是沙门菌属水平转移获得的毒力基因,在沙门菌入侵宿主和抵抗多粘菌素B(简称PB)的杀伤作用等方面有着重要作用,但其具体作用机制尚不明确。本论文旨在研究Mig-14参与伤寒沙门菌抵抗PB杀伤的分子机制。方法:(1)多粘菌素B作用下mig-14基因表达谱分析体外普通LB中加入PB致终浓度为0.1μg/ml,分别培养伤寒沙门菌野生株(WT)和mig-14基因缺陷变异株(△mig-14)5 h(37oC,250 r/min)后,提取WT和△mig-14的总RNA,反转录成c DNA并标记荧光(cy3或cy5),与基因组芯片杂交,扫描后据荧光信号分析各基因转录表达水平,比较WT和△mig-14在PB作用下的基因表达谱差异;选择部分差异表达基因进行荧光实时定量RT-PCR分析,验证DNA芯片分析结果。(2)WT与△mig-14的Omp C::3×Flag,Omp F::3×Flag标签融合菌株制备采用自杀质粒p GMB151介导的同源片段重组方法,在伤寒沙门菌WT与△mig-14的omp C、omp F基因的终止密码子前分别插入3×Flag标签,制备WT-Omp C::3×Flag、WT-Omp F::3×Flag标签变异菌株,△mig-14-Omp C::3×Flag、△mig-14-Omp F::3×Flag标签变异菌株。(3)Western Blot免疫印迹法检测WT和△mig-14中Omp F和Omp C的表达量PB刺激条件下培养WT-Omp C::3×Flag、WT-Omp F::3×Flag标签变异菌株与△mig-14-Omp C::3×Flag、△mig-14-Omp F::3×Flag标签变异菌株,收集全菌蛋白,以抗Flag单克隆抗体进行Western Blot免疫印迹分析WT与△mig-14变异株孔道蛋白Omp C、Omp F表达的差异。(4)基因缺陷变异株的制备采用自杀质粒介导的同源重组方法制备伤寒沙门菌各基因缺陷变异株。根据S.Typhi的omp C基因碱基序列,设计相应引物,并在5′末端加上Bam H I的特异性酶切位点。扩增omp C基因片段,利用粘性末端特性连接成omp C基因的不完全同源性核苷酸片段。胶回收后热击入E.coli,筛选阳性质粒,然后电转导入伤寒沙门菌野生株WT、omp F缺陷株(简称△omp F)(实验室保存)、mig-14缺陷株(简称△mig-14)(实验室保存),进行同源重组。用PCR观察重组现象,将相应完全重组的菌株作为omp C基因的缺陷变异株、omp C/omp F、mig-14/omp C双缺陷变异株(分别简称△omp C,△omp C/omp F、△mig-14/omp C)。将本实验室保存的含omp F同源缺失片段的阳性质粒电转至△mig-14和△mig-14/omp C,进行同源重组,制备mig-14/omp F及mig-14/omp C/omp F三缺陷变异株(分别简称为△mig-14/omp F、△mig-14/omp C/omp F),并通过PCR及序列分析鉴定技术加以确定。(5)各菌株抵抗PB杀伤能力分析以横坐标为培养时间,OD600吸光度值为纵坐标绘制生长曲线,对比各个基因缺陷变异株与野生株在PB杀伤作用下的生存情况。(6)Mig-14对生物膜形成能力的影响把野生株、△mig-14、△mig-14(空p BAD)、△mig-14回补株分别培养至OD6000.6后取等量的菌放置96孔板30oC静置培养3天后,甲醇30分钟固定,结晶紫对生物膜染色,用乙酸溶解后酶标仪测定OD570紫外吸收值,紫外吸收值代表生物膜生成量,比较伤寒沙门菌WT与△mig-14生物膜生成能力。结果:(1)PB刺激下Mig-14基因表达谱分析基因表达谱比较分析结果表明,与野生株相比伤寒沙门菌mig-14基因缺陷变异株在PB刺激5小时后,有768个基因表现出明显的表达差异。其中,鞭毛相关基因、外膜孔道蛋白相关基因omp C、omp F表达上调、侵袭和毒力相关基因表达下调。RT-PCR验证结果显示,与基于DNA芯片的基因表达谱分析数据相比,两者变化情况趋势一致。(2)WT与△mig-14的Omp C::3×Flag,Omp F::3×Flag标签融合菌株制备经PCR及序列分析证实成功在伤寒沙门菌WT与△mig-14缺陷株的omp C、omp F基因终止密码子前插入3×Flag标签,成功制备WT-Omp C::3×Flag,WT-Omp F::3×Flag融合标签变异株以及△mig-14-Omp C::3×Flag,△mig-14-Omp F::3×Flag融合标签变异株。(3)Western Blot免疫印迹法分析WT和△mig-14中Omp F和Omp C的表达差异Western-bolt结果显示,相比于WT在PB刺激下△mig-14的孔道蛋白Omp C,Omp F表达量明显增多。(4)基因缺陷变异株的制备经序列鉴定技术分析证实成功构建伤寒沙门菌△omp C、△omp C/omp F、△mig-14/omp C、△mig-14/omp F、△mig-14/omp C/omp F变异株。(5)各菌株抵抗PB杀伤能力分析结果显示△mig-14生存能力明显弱于WT,而且△mig-14/omp F、△mig-14/omp C及△mig-14/omp C/omp F生存能力强于△mig-14。(6)Mig-14对伤寒沙门菌生物膜形成能力的影响生物膜试验结果显示△mig-14缺陷的情况下,相比于WT生物膜形成能力降低。结论:PB刺激条件下,伤寒沙门菌Mig-14可调节多种基因的表达。mig-14缺失后,omp C及omp F的表达上调。在mig-14缺失的基础上缺失omp F或omp C后,伤寒沙门菌在PB刺激条件下的生存能力有所提高,但并未达到野生株水平。本研究进一步发现Mig-14可促进生物膜的形成。综上所述,Mig-14可能通过改变细菌膜的渗透性及促进生物膜的形成以抵制PB的杀伤作用。
【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R440

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