金、银纳米材料在沙眼衣原体核酸检测中的应用研究

发布时间：2020-03-18 20:22

【摘要】：基于金、银两种贵金属纳米粒子的特性,构建了金纳米颗粒银染色和银纳米簇荧光竞争检测沙眼衣原体两种方法,为沙眼衣原体检测提供新的途径。第一章:分析沙眼衣原体TrpB保守基因序列,设计两条特异性的寡核苷酸链,一条进行巯基修饰与柠檬酸钠还原法制备的金纳米颗粒结合得到信号探针,另一条用生物素标记作为捕获探针。靶序列与两种探针在包被链霉亲和素的酶标板内形成牢固的带有金纳米颗粒的核酸复合物。加入银染色液后金纳米催化银离子还原并聚集在96孔板底部。结果可通过酶标仪读取或直接肉眼观察。检测体系信号强度与靶序列浓度成正比。对杂交时间、杂交温度、银染色时间、探针浓度进行条件优化,提高金纳米银染检测体系的特异性和灵敏性,与其他生殖道病原菌无明显交叉反应。金纳米银染检测体系最低检测核酸浓度为55 pmol/L。49例临床标本检出率为61%,与实时荧光定量PCR法(Real-time Quantitative PCR,qPCR)相比检出率无显著性差异(P0.05)。第二章:设计两条DNA银纳米簇链构建银纳米簇探针检测体系,通过硼氢化钠还原法制备两条互补的低荧光银纳米簇探针,两条DNA银纳米簇探针会通过碱基互补配对形成银纳米簇对使荧光急剧增强。靶序列与银纳米簇发生竞争结合,致使靶序列含量与荧光强度呈反比,结果通过荧光分光光度计进行检测。对银纳米簇的稳定性、反应时间、反应温度等条件进行优化,提高了银纳米簇探针检测体系的特异性和灵敏性,重复性较好,与其他生殖道病原菌无明显交叉反应。银纳米簇探针检测体系最低检测核酸浓度为0.29 nmol/L,46例临床标本检出率为56%,与荧光定量PCR法相比检出率无显著性差异(P0.05)。结论:基于金、银两种贵金属纳米粒子的特性,建立的沙眼衣原体检测方法具有良好的灵敏度和特异性,操作相对简单,成本低廉,是沙眼衣原体的临床病原学诊断的更佳途径。
【图文】：

金纳米颗粒,细胞,培养基,细胞培养

12图 2.1 金纳米颗粒银染检测方法原理图Fig.2.1 Principle diagram of silver dyeing method for gold nanoparticles2.3.2 HeLa 细胞培养在 HeLa 细胞进入对数生长期时对其进行传代培养。倒掉旧培养基后用高压灭菌的 PBS 进行润洗，重复两遍后，加入适量 0.25%胰酶细胞消化液。放入37 °C 温箱消化 1 min 后，用显微镜观察。当细胞胞质收缩，细胞间隙变大，细胞开始变椭圆时，加入 3~4 ml DMEM（10%FBS）培养基使消化终止，同时用吹打管不断吹打瓶壁，吹落贴壁细胞并使细胞成为分散单个状态；以 1:3 比例转入新的细胞培养瓶中，之后补充 DMEM（10%FBS）培养基至每瓶约 3~4 ml 状态。

照片,金纳米颗粒,透射电镜,照片

染核酸杂交法与 qPCR 法进行配对卡方检验，以空白孔 A630光度大于临界值为阳性，低于临界值为阴性，通过 SPASS 处理。纳米颗粒和探针表征柠檬酸钠还原法制备的金纳米颗粒，通过透射电子显微电镜水平下可以观察到以柠檬酸钠还原法所制备的金纳米聚集，金纳米颗粒大小基本一致，，大多数金纳米颗粒的粒（图 2.2）。为进一步确定所合成金纳米颗粒粒径，本实验检测后发现所制备的金纳米颗粒平均粒径在 20.79 nm 左右 0.048，说明大多数颗粒粒径均在 20.79 nm 左右，且呈单峰中没有其他颗粒杂质的影响（图 2.3）。
【学位授予单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R518;R440

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