肺炎链球菌分子分型方法的建立及应用

发布时间：2020-03-25 14:27

【摘要】：目的建立基于核酸的肺炎链球菌体外变温扩增(包括普通PCR,多重PCR和荧光定量PCR)和环介导的等温扩增分子血清分型方法,从而达到简单快速地对肺炎链球菌进行种属鉴定和血清群/型分型的目的,并对中国分离的肺炎链球菌菌株进行分子血清分型,初步了解中国肺炎链球菌的流行情况以及不同血清群/型的分布状况;对侵袭性肺炎链球菌19A、19F血清型菌株进行多位点序列分型(MLST)分析,对来自中国的侵袭性肺炎链球菌19A、19F血清型的菌株进行基因型特征的研究;使用高通量全基因组测序的技术,分析肺炎链球菌全基因组序列,探讨不同血清群/型肺炎链球菌的遗传进化关系。方法收集肺炎链球菌菌株,对菌株进行生化方面的鉴定和血清分型。寻找血清型特异核酸序列,设计并合成引物及探针,检测肺炎链球菌种属特异性基因和血清群/型特异性基因,优化变温扩增和等温扩增的反应条件和体系,确定方法的特异性和敏感性,将所建立的方法应用于肺炎链球菌菌株和标本核酸的检测;针对从临床分离得到的侵袭性肺炎链球菌19A、19F血清型菌株,用多位点序列分型(MLST)进行ST分型,BioNumerics软件处理分型数据,对来自中国的侵袭性肺炎链球菌19A、19F血清型的菌株聚类分析;对肺炎链球菌菌株进行高通量全基因组测序并对核心基因组进行系统进化的分析,研究中国临床分离到的不同血清型肺炎链球菌菌株之间的亲缘关系。结果变温扩增的全部引物和探针能够特异性对肺炎链球菌进行种属鉴定和血清分型,而等温扩增引物对肺炎链球菌种属鉴定特异性良好,但只有部分血清群/型分型引物可特异性对肺炎链球菌进行血清分型;中国侵袭性肺炎链球菌19A和19F血清型菌株均有多个ST型,且各有主要的ST型,19A血清型以ST320为主,19F血清型以ST271为主,19A、19F血清型菌株有共同的序列型ST320;不同血清型肺炎链球菌全基因组序列(WGS)聚类分析表明,WGS分型能够提供更多的肺炎链球菌不同菌株之间的遗传信息。结论初步建立了基于核酸的肺炎链球菌变温扩增和等温扩增种属鉴定和血清群/型分型技术,可用来研究人群中主要流行的肺炎链球菌血清群/型;通过中国侵袭性肺炎链球菌19A、19F血清型菌株的MLST数据分析,掌握中国肺炎链球菌的ST型分布情况,分析肺炎链球菌荚膜的转换和血清型替换的趋势,以评价肺炎球菌疫苗的应用效果;高通量测序全基因组序列分析,从基因组水平表明了肺炎链球菌菌株之间的遗传进化关系。
【图文】：

肺炎链球菌,血清型,多重PCR,多重

3.5.2 扩增结果根据琼脂糖凝胶电泳图中所得条带亮度的差异，优化多重 PCR 扩增的反应体系反应条件，调整每对引物的反应浓度，，得到最优化的反应体系和条件。多重 PCR 扩结果详见图 1.2。　 300 　 200 　　 400 　　 30019A 400 269 2 350 290 19F 400 304 33F 450 338　 400 　　 350 　　 400 　　 45011A 400 348 12F 200 376 23F 400 384 4 350 430　 400 　　 200 　　 400 　 350 　5 400 443 15B 200 496 20 400 514 9N 200 516　 400 　 200 　 400 　 200 　1 400 555 18C 350 573 7F 200 599 10A 500 628　 400 350 　　 200 　　 500 　22F 400 643 17F 500 693 9V 300 816 cpsA 150 160　 400 　　 500 　 300 　　 150 　cpsA 150 160 cpsA 150 160 cpsA 150 160150 150 　 150 　

扩增曲线,肺炎链球菌,血清分型,血清型

图 1.3 肺炎链球菌 qPCR 扩增曲线图表 1.1 肺炎链球菌 qPCR 血清分型 Ct 值血清型荧光 Ct 值1 FAM 17.343 HEX 16.934 CY5 15.955 FAM 16.846A FAM 16.116B FAM 14.307F CY5 15.529V HEX 17.5114 FAM 19.0918C HEX 16.16
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R446.5

【参考文献】