多重快速检测6种呼吸道病毒的研究

发布时间：2020-03-28 04:56

【摘要】：传染病是一类让国际卫生组织及各大医院、疾病控制中心对之时刻保持高度警惕的一类疾病,通常由某种特异性的病原引起,可以在人与人,动物与动物,人与动物之间相互感染传播。传染病的暴发和流行对人类的生命财产构成了巨大的威胁,历史上几次大的传染病的暴发流行,可以说是触目惊心,在很短时间内就能在全球各个城市大范围的流行,严重的甚至可以使一个城市瘫痪。尤其是呼吸道病毒引发的疾病。早期预防和快速而又精准的诊断,对传染病的防治来说至关重要。能够引起传染病的病原微生物种类很多,其中,致病最频繁、危害最严重的莫过于病毒。尤其是近几年SARS、H1N1、H5N1、H7N9、EBOLA、MERS病毒的出现和暴发,让我们认识到与病毒的抗争任重而道远。本研究首先建立了鼻咽拭子病毒核酸快速提取方法,再讨论了聚合酶螺旋反应扩增RNA的可行性,然后针对6种呼吸道病毒(甲型H1N1流感病毒,甲型H5N1流感病毒,甲型H7N9流感病毒,甲型H3N2流感病毒,腺病毒,人偏肺病毒)建立快速检测方法,最后组装了可以在一个小时内多重快速检测这6种病毒的试剂盒。核酸提取已经成为分子生物学实验技术中最重要、最基本的操作,但是目前病毒核酸的提取方案非常多,而且繁简不一。基层的人员密集的单位往往是传染病暴发的起点,非常需要在原地能迅速的对核酸进行诊断,这对传染病的防控有重大的意义。然而事实是,根据现场或者基层的检测和治疗条件,要求检测试剂盒的特点是快速、操作方便、使用简单、无仪器化、专业化需求低。我们根据实际情况研究并制作了鼻咽拭子病毒核酸快速提取液,操作过程操作简单,无需任何仪器,既能常温保存,又能有效防止交叉污染,专业化程度需求低,无需提前配液,5分钟内可以提取完成,可以直接用于后续的核酸扩增反应,包括常规PCR、荧光定量PCR、PSR、LAMP等温扩增等。聚合酶螺旋反应已经成功应用于检测多种细菌和DNA病毒,如肺炎克雷伯杆菌、铜绿假单胞菌和肠道病毒71型等,均可在较短时间内检测出相应病原微生物,并且特异性很高,为此类疾病提供了一种新的便捷可靠的检测方法和诊断依据。本研究首先探讨聚合酶螺旋反应扩增RNA的理论可行性,由于PCR法需要热循环,其中一个温度为90℃-95℃,在这个温度下逆转录酶是没有活性的,这也就决定了荧光定量PCR法在检测RNA病毒时需要分成两个步骤,先在较低温度下逆转录RNA,然后再热循环扩增cDNA,这样就必然使检测的时间变长。我们在研究逆转录酶时,发现其在30℃-68℃的情况下仍然存在活性,这个温度范围包含了聚合酶螺旋扩增的温度,这样的话就可以让二者同时进行,避免了分两次反应的麻烦,大大节省了时间。该推论在本研究中也得到了证实,在这种方法下建立的聚合酶螺旋反应操作更加简单、方便,同时拓展了聚合酶螺旋反应的应用范围。流行性感冒是最为常见的一种呼吸道疾病,由流感病毒引起,传播速度快,易暴发流行。每年全世界的各个国家都会出现流感的季节性流行以及地域性的暴发,据世界卫生组织资料统计,每年感染的人之中,有300万至500万会发展成为重症感染,约30至50万人死亡,属于较为常见且较难防控的传染病之一。流行性感冒在治疗和防控中的最大难题是,流感病毒容易发生抗原性变异,从而使得该病毒能够逃脱宿主的免疫识别,引发了新类型流感的暴发和流行。针对甲型H1N1流感病毒,甲型H5N1流感病毒,甲型H7N9流感病毒,甲型H3N2流感病毒,腺病毒,人偏肺病毒6种病毒的特异性基因,设计了PSR引物,通过实时浊度法和显色法两种方法判断结果。确定各自最佳温度;进一步实验表明引物具有良好的特异性与其他呼吸道病原核酸无交叉反应,敏感性达到10-100拷贝,比普通PCR敏感性高出10-100倍。该方法具有简单快速,特异性强,敏感性高等特点,特别适合现场和基层单位应用推广。本研究成功建立了“室温贮运、开封即检、操作便捷、结果直观”的6种呼吸道病毒快速检测试剂盒,该试剂盒由“采样棉签、样品处理管、检测管、恒温仪”4部分组成。经过“棉签采样、震荡裂解、滴加样本、恒温扩增、观察结果”5个简单操作步骤,1个小时内全部完成。不需要其它仪器设备配合,不需要配制任何液体,甚至在断水断电的极端环境下也能开展核酸检测。适合基层卫生单位推广应用。
【图文】：

聚合酶,引物,螺旋

应过程中最关键的一种酶，即 Bst DNA 聚合酶，是一种具性以及 DNA 聚合酶活性的酶，实验数据表明其最适反应温 CPA 法都是基于此酶的核酸等温扩增方法。作为一种新，基于 Bst DNA 聚合酶的聚合酶螺旋反应采用了混合引物复合引物 Ft 和 Bt，也是聚合酶螺旋反应的主引物，如图 0-本引物 FB 和 BP 作用下就可以发生 PSR 反应，但这个过一般在 50min 左右。如果再引入两条加速引物 IF 和 IB，大大缩短，一般可在 30min 内完成。IF 和 IB 能起到加速 PSR 必须引物。PSR 的发生只要含有最基本引物就可以，，加速引物的条数≥0 条，根据实验的不同可以任意搭配。只使用一条加速引物时，，提高了反应速率，但是远远不如，出峰时间甚至能提前至 20min 以内。

示意图,提取装置,核酸,加样

军事科学院博（硕）士学位论文 1-1 所示，本产品包括 a 和 b 两端加样端，枪口上游带有滤膜，可间为上样处，可以用力打开，加样多次优化得到的。既保证了对样样本时，可以吸附样本中杂质，同
【学位授予单位】：军事科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R446.5

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