两种基于核酸扩增技术的阿萨希毛孢子菌快速检测和鉴定方法的建立及应用

发布时间：2020-03-28 06:55

【摘要】：研究背景和目的:关于毛孢子菌感染的流行病学研究显示,毛孢子菌已成为恶性血液病患者真菌血症中第二大常见的酵母类致病菌。在侵袭性酵母菌感染中,毛孢子菌的致病几率仅次于念珠菌和隐球菌。阿萨希毛孢子菌(Trichosporon asahii,T.asahii)是临床分离毛孢子菌中最常见的菌种。播散性毛孢子菌病的死亡率高达50%~80%,在恶性血液病并出现持续性中性粒细胞减少患者中,死亡率甚至可达100%。由于侵袭性或播散性毛孢子菌感染患者病情常迅速变化,快速准确的诊断方法对于临床抗真菌药物的及时合理应用、扭转高死亡率局面极其重要。核酸扩增技术由于可快速高效扩增病原菌特征性核苷酸序列,已在毛孢子菌感染的诊断中得到广泛应用。但是,既往的核酸扩增技术大多依赖于病原菌纯培养、DNA提取和后续的产物测序才能获取检测结果,严重削弱了核酸扩增技术的高时效性优势。为提高核酸扩增技术在毛孢子菌感染诊断中的总体时效性,我们选择基于菌落PCR技术(无需复杂的DNA提取步骤)和重组酶聚合酶扩增技术(扩增时间10~20min),建立2种分别适用于设备技术条件充足和设备技术匮乏地区和机构的T.asahii感染快速诊断方法。本研究的第一部分旨在建立一种可以取代核酸扩增前DNA提取过程的T.asahii菌落DNA快速释放方法,并初步形成T.asahii感染临床易获取样本快速处理策略;第二部分和第三部分旨在基于第一部分研究成果,实现菌落PCR技术和菌落RPA技术对T.asahii的特异性快速检测,并观察该2项技术对临床样本检测的适用性;第四部分旨在通过T.asahii播散性感染小鼠模型验证2种快速检测方法的实用性。主要实验方法:第一部分:采用PCR技术以IGS区通用引物进行扩增,评价玻璃珠法、冻融法、直接法、酶解法和常规DNA提取法对T.asahii DNA的释放效率,并观察最优方法处理T.asahii模拟感染临床样本的性能。1.以各方法处理后的T.asahii CBS2479浓度梯度菌悬液作为PCR模板扩增,进行敏感性检测;2.以各方法处理后的15株T.asahii菌株10~3CFU/mL的菌悬液作为PCR模板扩增,进行阳性率检测;3.以敏感性、阳性率间接评价4种方法对T.asahii的菌落DNA释放效率,并与常规提取法进行比较,筛选出一种最优的T.asahii菌落DNA快速释放方法;4.采用响应面法对最优方法进行优化,并通过PCR扩增的敏感性变化验证优化后方法DNA释放效率的提高;5.以最优方法为基础对T.asahii模拟感染的全血、尿液和支气管肺泡灌洗液(Bronchoalveolar lavage fluid,BALF)样本进行处理,以PCR扩增结果间接评价模拟样本中T.asahii基因组DNA的释放效率,并对模拟样本处理方法做相应改进。第二部分:建立菌落PCR技术快速检测和鉴定阿萨希毛孢子菌的方法。1.基于15个T.asahii IGS区基因型和近缘菌种IGS序列的比对结果,手工设计T.asahii种特异性引物;2.根据引物对小样本量菌种的特异性表现进行引物筛选,而后基于盲法设计通过大样本量菌种验证最优引物特异性;3.观察菌落PCR技术对连续稀释T.asahii菌悬液和DNA样本的检测敏感性;4.采用正交设计优化菌落PCR反应体系,通过敏感性检测水平变化验证优化后菌落PCR扩增效率的提高,并复核菌落PCR检测的特异性;5.应用凝胶电泳成像和直接荧光显色法观察菌落PCR技术对T.asahii模拟感染样本的检测敏感性和检出率。第三部分:建立菌落RPA技术快速检测和鉴定阿萨希毛孢子菌的方法。1.基于第二部分引物设计所采用的T.asahii与近缘菌种IGS序列差异区,按照RPA引物设计要求,手工设计T.asahii种特异性引物;2.应用小样本量菌种观察引物特异性,并通过温度梯度扩增优化引物特异性;3.基于盲法设计,应用大样本量菌种验证引物特异性;4.观察RPA技术对连续稀释T.asahii DNA样本的检测敏感性;5.采用正交设计优化RPA反应体系和条件,通过敏感性检测水平变化验证优化后RPA扩增效率的提高,并复核RPA检测的特异性;6.观察玻璃珠法与RPA技术联合应用对连续稀释T.asahii菌悬液的检测敏感性;7.分别应用凝胶电泳成像和直接荧光显色法观察菌落RPA技术对T.asahii模拟感染样本的检测敏感性和检出率。第四部分:在T.asahii播散性感染小鼠模型中验证菌落PCR技术和菌落RPA技术的实用性。1.应用环磷酰胺和地塞米松对小鼠进行免疫抑制,通过尾静脉接种T.asahii,建立T.asahii播散性感染小鼠模型;2.通过真菌镜检、液体标本和组织匀浆真菌培养、组织病理学检查和培养阳性菌株菌落PCR产物测序比对,确证感染菌种及模型建立是否成功,并计算各器官载菌量;3.分别应用菌落PCR技术和菌落RPA技术对6个时间点的血液、尿液和BALF进行检测。主要实验结果:第一部分:玻璃珠法可高效释放T.asahii菌落DNA,且适用于对全血、尿液和BALF的处理。1.基于玻璃珠法、冻融法处理后的PCR检测敏感性为3×10~2CFU/mL,直接法、酶解法和常规DNA提取法的敏感性为3×10~3CFU/mL;2.基于玻璃珠法处理后的PCR检测阳性率为100%,明显高于其它4种方法;3.玻璃珠法处理耗时短于除直接法外的其它方法;4.经优化后玻璃珠法处理后的PCR检测敏感性提高至3.0×10~1 CFU/mL;5.经玻璃珠法处理的3种临床样本其PCR检测敏感性均为3.0×10~1 CFU/mL,且在全血样本玻璃珠法处理后增加浓缩纯化步骤可使PCR检测敏感性提高1个数量级。第二部分:T.asahii菌落PCR快速检测和鉴定方法具有高敏感性和高特异性,适用于对全血、尿液和BALF中T.asahii的直接检测。1.采用引物TA4F和TA4R的菌落PCR技术在优化前后对非T.asahii菌株均无扩增;2.优化后的菌落PCR技术对T.asahii菌悬液和DNA样本的检测敏感性分别为10 CFU/mL和1fg/μL;3.凝胶电泳成像和荧光显色结果一致,菌落PCR技术对模拟感染的全血样本检测敏感性为30 CFU/mL,对尿液和BALF的敏感性为10 CFU/mL,对孢子浓度为300CFU/mL的模拟样本检出率为100%。第三部分:T.asahii菌落RPA快速检测和鉴定方法可在短时间内快速完成T.asahii的准确检测,可直接检测全血、尿液和BALF中的T.asahii。1.基于引物TA4RPAF和TA4RPAR4的RPA技术在反应温度为47.5℃时满足对T.asahii特异性扩增要求;2.优化后的RPA技术检测T.asahii DNA和菌悬液样本的敏感性分别为1fg/μL和30 CFU/mL;3.菌落RPA技术检测对模拟感染的全血、尿液和BALF样本的检测敏感性均为30 CFU/mL,对模拟感染样本的检出率均为100%,且凝胶电泳成像和荧光显色法对敏感性的判读结果一致。第四部分:2种检测方法均可在经确证的T.asahii播散性感染小鼠模型全血、尿液和BALF中检出T.asahii。1.根据组织培养和测序鉴定结果,18只实验组小鼠均出现T.asahii播散性感染,模型建立成功;2.菌落PCR技术和菌落RPA技术检测实验组血液、尿液和BALF,结果均为阳性,对照组均为阴性;3.应用直接荧光显色与电泳成像均可对检测结果进行准确判断;4.菌落PCR技术和菌落RPA技术可在血行播散后6h于小鼠血液、尿液和BALF检出T.asahii。主要结论:1.在应用核酸扩增技术检测前,玻璃珠法可作为高效释放全血、尿液和BALF中T.asahii DNA的方法,在扩增后可应用荧光显色法直接读取结果;2.成功建立了可直接应用于全血、尿液和BALF的T.asahii菌落PCR快速检测和鉴定方法,可用于对T.asahii感染的即时诊断;3.成功建立了可直接应用于全血、尿液和BALF的T.asahii菌落RPA快速检测和鉴定方法,该法操作简单,耗时极短,可作为设备或技术匮乏机构即时诊断T.asahii感染的工具;4.可选择血液、尿液和BALF作为T.asahii播散性感染早期诊断的样本,2种快速检测和鉴定方法均可用于T.asahii播散性感染的早期诊断。
【图文】：

购于荷兰真菌生物多样性研究中心株复苏挑取冻存的少量菌液接种于 PDA 培养基中，，35℃培DA 培养基中进行传代，培养条件同样为 35℃培养 4悬液配制盐水冲洗多份 PDA 培养基中的菌落，并将冲洗后的菌500rpm 转速离心 1min 后，小心吸取上清弃掉，而后osphate buffer saline，PBS）重新悬浮孢子，再次以 1 PBS 清洗步骤一次后，向离心后沉淀中加入 5mL 生理行 10 倍浓度梯度倍比稀释，应用血细胞计数板计数FU/mL。将此菌悬液 1500rpm 离心 1min 后弃掉上清，并用 TE 缓冲液连续倍比稀释得到 107、106、105、的菌悬液（图 1-2）。

1-3 不同菌落 DNA 释放方法的 PCR 敏感性检测电泳图。1-7 的菌悬液浓度依次U/mL、3×106CFU/mL、3×105CFU/mL、3×104CFU/mL、3×103CFU/mL、3×102CFCFU/mL；8：Negative Control；M：DNA Ladder Marker；A：玻璃珠法；B：冻融；D：酶解法；E：常规提取法。.3.2 阳性率检测检验各种菌落 DNA 释放技术对低浓度 T. asahii 的作用，我们选择了 mL 作为检测浓度，理想状态下，在 PCR 体系中加入上述菌液 2μL，相当通过 3 次重复实验对 15 株上述浓度菌悬液为模板进行 PCR 扩增后，玻 15 条特异性条带，阳性率为 100%，与其它方法做独立样本 t 检验，p＜表 1-5)；冻融法 3 次扩增分别得到 11、12、10 条特异性条带，阳性率%（图 1-4B）；直接法分别得到 12、12、11 条特异性条带，阳性率为 73.；酶解法分别可见 14、13、13 条特异性条带，阳性率 77.78%(图 1-4D)；分别得到 8、7、9 条特异性条带，阳性率为 53.33% (图 1-4E)。
【学位授予单位】：中国人民解放军陆军军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R446.5


本文编号：2604099