下调NEK2对人肺癌细胞A549放射敏感性的影响及作用机制研究

发布时间：2020-03-30 04:37

【摘要】：目的研究NEK2在非小细胞性肺癌中的表达以及siRNA下调NEK2表达后对非小细胞性肺癌A549细胞增殖和放射敏感性的影响及其相关机制。方法通过Oncomine数据库分析不同人群中NEK2在非小细胞性肺癌及其癌旁正常肺组织中的差异表达,Western blot检测NEK2在三种非小细胞性肺癌细胞A549,H460和H1299及两种肺正常细胞HFLIII和HBE中NEK2蛋白表达情况,并通过体外实验研究下调NEK2对非小细胞性肺癌的放射敏感性的影响及其机制。本研究通过:(1)Western blot法验证NEK2 siRNA在A549细胞中的沉默效果;(2)克隆形成实验检测转染NEK2 siRNA后对A549细胞增殖和放射敏感性的影响;(3)流式细胞计数法检测下调NEK2表达对A549细胞辐射诱导的凋亡和周期阻滞的影响;(4)细胞衰老β-半乳糖苷酶染色实验检测下调NEK2表达对A549细胞辐射诱导的衰老的影响;(5)细胞免疫荧光法检测下调NEK2表达对辐射诱导的DNA双链断裂形成与修复的影响以及对细胞有丝分裂形态和核形态的影响;(6)Western blot法检测A549细胞照射前NEK2敲除后,细胞凋亡、周期、DNA损伤修复等相关蛋白表达水平的变化。结果NEK2在非小细胞肺癌组织中的表达明显高于癌旁组织,在三种非小细胞肺癌细胞中的表达也明显高于两种正常肺细胞。体外实验结果:(1)Western blot结果显示siRNA转染A549细胞24和48h后,两个不同的NEK2 siRNA均能明显抑制NEK2的表达;(2)在A549细胞中转染siRNA下调NEK2表达后能够抑制A549细胞的增殖能力(p0.05);(3)克隆形成实验检测下调NEK2表达可以提高A549细胞对放射的敏感性,其中平均致死剂量(D_0)从2.34Gy下降到2.03Gy(siRNA1)和1.65Gy(siRNA2),放射增敏比(SER)分别为1.16(siRNA1)和1.42(siRNA2);(4)下调NEK2表达联合4Gy X射线能够增加A549细胞的凋亡率,细胞凋亡率由10.42%增长至16.68%。Western blot结果显示PARP、Caspase3总蛋白表达下降,活化的PARP、Caspase3表达增高,凋亡抑制蛋白Bcl2的表达下降,与流式细胞仪检测结果一致,下调NEK2表达可以促进辐射诱导的细胞凋亡;(5)下调NEK2表达可以增加辐射诱导的G2/M期阻滞,增加细胞对射线的敏感性,Western blot结果显示,下调NEK2可以减少细胞周期蛋白p-CDC25C和CDK1的表达,从而抑制了G2/M期的转换;(6)β-半乳糖苷酶染色实验检测发现,下调NEK2表达可以明显增加辐射诱导的A549细胞的衰老比例,从11.70%升高至26.65%;(7)细胞免疫荧光法检测下调NEK2表达能增加辐射诱导的γ-H2AX焦点的形成并延长其存在的时间;Western blot结果显示DNA损伤修复关键蛋白Rad51的功能受到抑制从而影响DNA双链断裂的修复效率;(8)细胞免疫荧光实验通过对α-tublin和γ-tublin免疫荧光染色观察细胞有丝分裂形态变化以及通过DAPI染色观察细胞核形态变化,下调NEK2表达明显增加了辐射诱导的染色体分离失误比例和异常核形态比例,从17.82%增长至44.64%。结论NEK2在非小细胞性肺癌中高表达;转染NEK2 siRNA后能够明显下调人非小细胞性肺癌A549细胞中NEK2的表达并能抑制细胞的增殖能力;下调NEK2表达:能够明显提高A549细胞的放射敏感性;诱导辐射诱导的A549细胞的凋亡、衰老和有丝分裂失误;延长辐射诱导的A549细胞的G2/M期阻滞;增加辐射诱导的DNA双链断裂形成数量并抑制DNA损伤修复效率。
【图文】：

.1 NEK2 mRNA 在非小细胞性肺癌及其癌旁组织中的表K2 在非小细胞性肺癌细胞中的表达情况ern blot 检测人肺正常细胞 HFLIII 和 HBE 以及非 H1299 中的 NEK2 蛋白表达水平(图 1.3.2)。实验49，H460 和 H1299 细胞系中的表达水平明显高于在三种肺癌细胞系中，NEK2 在 A549 细胞系中的中的表达，因此选用 A549 细胞进行接下来的相图 1.3.2 NEK2 在非小细胞性肺癌细胞中的表达情况

2 mRNA 在非小细胞性肺癌及其癌旁组织中的小细胞性肺癌细胞中的表达情况 检测人肺正常细胞 HFLIII 和 HBE 以及 中的 NEK2 蛋白表达水平(图 1.3.2)。实60 和 H1299 细胞系中的表达水平明显高癌细胞系中，，NEK2 在 A549 细胞系中达，因此选用 A549 细胞进行接下来的
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R734.2;R730.55

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本文编号：2607048