功能磁共振评价糖尿病肾病基础上碘对比剂诱导急性肾损伤及SIRT1的保护作用及机制研究

发布时间：2020-04-01 17:53

【摘要】：随着人口老龄化的不断增加,高血压、糖尿病、慢性肾功能不全的患者数量明显增多~([1]),其在使用碘对比剂时造成的急性肾损伤即对比剂肾病(contrast-induced nephropathy,CIN)~([2,3])或碘对比剂诱导的急性肾损伤(post-contrast acute kidney injury,PC-AKI)~([4])已成为一个不容忽视的临床问题。临床上采用血肌酐监测PC-AKI的发生,但由于血肌酐多在患者使用碘对比剂之后3天内升高,造成临床诊断推迟,延长患者住院时间,错过最佳诊疗时间~([5])。因此,寻找可以早期诊断PC-AKI的指标有重要的意义。目前,功能磁共振技术发展较为迅速,可以在肾脏病理学结构发生异常之前,做出肾功能异常的诊断。将功能磁共振技术用于PC-AKI的监测中,使得指标多样,系统,全面,并且可以较临床指标更早期诊断碘对比剂造成的急性肾损伤,增加了功能磁共振技术在临床的使用范围。血氧水平依赖成像(blood oxygenation level dependent,BOLD)技术可以为碘对比剂注射后肾脏的氧代谢提供半定量的方法~([6])。体素内不相干运动成像(Intravoxel incoherent motion,IVIM)技术可以观察组织水分子扩散及毛细血管灌注扩散情况,很好的评价肾脏病理结构改变、微循环灌注情况及体液变化~([7])。目前,关于PC-AKI发病机制尚未完全清楚明确。对于糖尿病肾病的肾组织细胞而言,接受碘对比剂后造成的肾脏缺氧,缺氧导致的氧化应激反应,以及氧化应激进一步产生的线粒体功能障碍和碘对比剂的毒性作用都将加重疾病的进展。因此,一个有效的干预策略应该同时具有阻断肾脏缺氧、氧化应激反应、线粒体受损的作用。沉默接合型信息调节因子2同源蛋白1(Silent information regulator l,SIRT1)是烟酰胺腺嘌吟二核甘酸(NAD+)依赖的脱乙酰化酶,在抵抗细胞缺氧、细胞凋亡、抗氧化应激和线粒体功能障碍等方面都发挥着重要的作用~([8])。目前,SIRT1和肾脏的关系正是研究的热点。摘要一目的:研究血氧水平依赖成像(blood oxygen level-dependent,BOLD)和体素内不相干运动技术(intravoxel incoherent motion,IVIM)评价糖尿病肾病实验兔在使用碘对比剂后肾功能的改变,实现应用无创影像学方法早期监测糖尿病肾病基础诱导对比剂肾病发生。研究方法:62只健康雄性新西兰大白兔,随机分为2组:糖尿病肾病+碘海醇组(diabetic nephropathy rabbits with the contrast agent,DCA)和健康大白兔+碘海醇组(healthy rabbits with the contrast agent,NCA),每组31只。耳缘静脉按100 mg/kg体重注射四氧嘧啶造糖尿病肾病模型。DCA组和NCA组按2.5 g I/kg体重注射碘海醇。在每组中,随机抽取6只实验兔进行功能磁共振技术基线扫描,并在注入碘海醇之后1小时,1天,2天,3天,4天重复扫描BOLD和IVIM图像,在全部扫描结束后处死5只实验兔取病理及血标本。每组剩余25只实验兔中,分别在基线、1小时、1天、2天、3天各对应时间点随机抽取5只在功能磁共振扫描结束后取肾脏标本和血标本。功能磁共振测量参数分别为表观横向弛豫速率R2~*、纯水分子扩散系数D、灌注相关扩散系数D~*和灌注分数f。对应相应的解剖结构,肾脏被分为三个带:皮质(CO),外髓(OM)和内髓(IM),感兴趣区分别画在这三个带上。结果:DCA和NCA组,与基线相比,肾脏的三个带(CO、OM和IM)D值和f值显著下降,尤其在第1天时下降最显著(P0.05);而D~*值在1小时下降最明显(P0.05)。DCA和NCA组,与基线相比,肾脏的三个带(CO、OM和IM)R2~*值在注入碘海醇之后出现显著上升,在第1天时上升最明显(P0.05)。DCA组中,肾脏的外髓(OM)R2~*出现持续升高,在第4天时仍比基线高(P0.05)。DCA组较NCA组肾脏出现明显的损伤改变,且DCA组在第4天时这种病理改变仍很明显。DCA和NCA组中,缺氧诱导因子和血管内皮损伤因子在第1小时开始升高,在第1天时表达最高,随即逐渐下降。DCA组中第4天时缺氧诱导因子和血管内皮损伤因子仍高表达。功能磁共振参数D,f和R2~*值与肾脏病理损伤评分,缺氧诱导因子1α,血肌酐有显著相关性。结论:联合磁共振BOLD和IVIM技术可以早期监测糖尿病肾病基础上碘对比剂诱导的急性肾损伤的发生。摘要二目的:研究SIRT1对糖尿病肾病实验兔碘对比剂诱导的急性肾损伤模型的保护作用及可能的保护机制。方法:对糖尿病肾病实验兔按2.5 g I/kg碘海醇建立碘对比剂诱导的急性肾损伤(post contrast induced acute kidney injury,PC-AKI)模型,采用SIRT1的激动剂白藜芦醇(resveratrol,Res)连续喂养糖尿病肾病和糖尿病肾病基础上对比剂肾病损伤模型14天。将所有糖尿病肾病实验兔随机分为4组,糖尿病肾病实验兔+生理盐水组(Cont)、白藜芦醇组(Res)、对比剂肾病组(PC-AKI)以及对比剂肾病+白藜芦醇组(PC-AKI+Res),每组6只。糖尿病肾病实验兔注入碘对比剂后1天时进行血氧水平依赖成像技术和体素内不相关运动扫描,同时耳缘静脉采血检测实验兔血肌酐(serum creatinine,Cr)、尿素氮(urea nitrogen,BUN),扫描结束后随即处死实验兔获取肾脏标本。Western blot检测各组间SIRT1、PGC-1α、HIF-1α和凋亡相关蛋白的表达量。为进一步证实SIRT1发挥保护作用的具体机制,取人的肾小管上皮细胞HK-2细胞,高糖预刺激后模拟糖尿病肾病模型。将培养好的HK-2细胞随机分为五组:白藜芦醇组(Res);Ex527组(Ex527);对比剂肾病组(PC-AKI);白藜芦醇+2-Me OE2组(2-Me OE2);对照组(Cont)。HK-2细胞分别给予高糖(25mmol/L)和低糖(5.5mmol/L)刺激24h后。将Res,Ex527,2-Me OE2预处理HK-2细胞后碘海醇按100mg/m L培养16h。结果:成功建立糖尿病肾病基础上碘对比剂诱导的急性肾损伤实验兔模型。PC-AKI+Res组对比PC-AKI组Cr、BUN水平下降(P0.05)。Res组对比Cont组肾脏皮质和髓质R2*、D、D*、f值差异无统计学意义(P0.05)。与PC-AKI组对比,Res+PC-AKI组髓质R2*显著下降(P0.05),D值,f值显著升高(P0.05,P0.05),皮质R2*显著下降(P0.05),D值,f值显著升高(P0.05,P0.05)。与PC-AKI组相比,灌注相关参数D*值在PC-AKI+Res组稍微升高,但不论在皮质(P0.05)还是髓质(P0.05)并没有统计学意义。病理显示Res组与Cont组无明显差别,PC-AKI组对比Cont组病理损伤程度明显,而PC-AKI+Res组对比PC-AKI组则减轻了肾脏损伤程度。与Cont组相比,PC-AKI组SIRT1蛋白(P0.05),PGC-1α(P0.05)表达量降低,HIF-1α(P0.05)和Cleaved Caspase-3(P0.05)蛋白表达量升高。相比PC-AKI组,Res+PC-AKI组SIRT1(P0.05),PGC-1α(P0.05)蛋白升高,HIF-1α(P0.05)蛋白和Cleaved Caspase-3蛋白(P0.05)表达量降低。体外实验中,与PC-AKI相比,Res组显著升高了SIRT1(P0.05)和PGC-1α(P0.05),降低了HIF-1α(P0.05)及其下游的相关蛋白Bax(P0.05)、Cleved Caspase-3(P0.05)、Cyt-C(P0.05)蛋白的表达。联合2-Me OE2可以加强白藜芦醇的作用。而SIRT1的抑制剂Ex527将显著抑制白藜芦醇的保护作用。与Cont组相比,Ex527组SIRT1(P=0.201)、PGC-1α(P=0.258)和Bcl-2(P0.001)下降,HIF-1α(P=0.008),Bax(P0.001),Cleved Caspase-3(P=0.001)和Cyt-C(P=0.001)显著升高。结论:SIRT1能有效减轻糖尿病肾病基础上碘对比剂诱导的急性肾损伤,其作用机制是通过SIRT1-PGC-1α-HIF-1α信号通路抑制肾小管上皮细胞凋亡、抑制氧化应激、促进线粒体生成而发挥作用。
【图文】：

实验流程,肾脏

中国医科大学博士学位论文7图1 实验流程图2.4.4 图像后处理扫描磁共振结束后，将扫描图像传到 GEadw 工作站进行图像后处理。根据文献[16]及结合动物解剖结构将肾脏分为肾皮质（cortex，CO），外髓（outer medulla，OM），内髓（inter medulla，IM）（图 2）。分别在右侧肾脏三个带勾画感兴趣区（regions ofinterest，ROIs）后得出 R2*值

肾脏,外髓,内髓,博士学位论文

中国医科大学博士学位论文7图1 实验流程图2.4.4 图像后处理扫描磁共振结束后，，将扫描图像传到 GEadw 工作站进行图像后处理。根据文献[16]及结合动物解剖结构将肾脏分为肾皮质（cortex，CO），外髓（outer medulla，OM），内髓（inter medulla，IM）（图 2）。分别在右侧肾脏三个带勾画感兴趣区（regions ofinterest，ROIs）后得出 R2*值
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R445.2;R587.2;R692.9

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