造血细胞靶向性腺病毒载体及诱导生成iPSC细胞的研究

发布时间：2020-04-01 15:21

【摘要】：血液中各种细胞成分均来自造血干细胞的增殖和分化,也是基因治疗最常用的靶细胞。重组腺病毒是开展临床试验最多的基因治疗载体,但由于造血细胞不表达腺病毒受体(CAR),其对血细胞的感染效率非常低。诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)是通过向分化的体细胞转入特定的外源转录因子进行重编程,从而获得具有自我更新能力和多能性的细胞,在基础研究、再生医学等众多科学领域中也有着广阔的发展前景和重要的意义。外周血细胞是诱导生成iPSCs的常用细胞类型。我们致力于借助基因治疗手段,对包括淋巴细胞和iPSCs在内多种细胞开展基因修饰或改造,将大力提升基因治疗在临床血液疾病中的应用。本课题主要研究了提高血细胞转染效率的重组腺病毒载体及血细胞诱导的重编程多能干细胞的特性。目的:(1)开展纤维顶球改构的人5型腺病毒对淋巴细胞的高效转染研究。(2)建立血细胞诱导生成多能干细胞(iPSCs)及分化为MSC的体系。方法:(1)首先,pShuttle-CMV中的CMV启动子被人EF1a启动子取代,产生穿梭质粒pSh5EF1a。其次,修饰骨架质粒pAdEasy-1中的纤维基因以产生HAdV-5载体的新骨架质粒。随后,通过用骨架质粒和线性化pSh5EG电穿孔大肠杆菌BJ5183菌株,用同源重组方法产生腺病毒质粒。用PacI消化上述获得腺病毒质粒,通过乙醇沉淀回收,并使用Lipofectamine 3000转染293细胞后三轮冷冻和解冻释放拯救的病毒,在293细胞中扩增。用传统的CsCl超速离心法纯化扩增的病毒。通过定量纯化病毒的基因组DNA来确定颗粒滴度,并通过对293细胞的有限稀释测定来确定感染滴度。选择U937,K562,Jurkat和HL-60的四种造血细胞系、人脐血来源CD34~+、人外周血来源T细胞用于评估4种纤维修饰的HAdV-5的基因转移能力。感染细胞并在2天后分析GFP荧光。(2)对抽取的5-10ml新鲜外周血进行稀释后梯度离心,获取外周血单个核细胞(peripheral blood-derived mononuclear cells,MNC)培养。使用编码OCT4、SOX2、KLF4和c-MYC的仙台病毒载体高效转染少量的淋巴细胞,驱动高度分化的淋巴细胞的命运发生转归,返回到具有多能性的干细胞状态。3-4w对出现的iPSCs克隆进行不断地传代,剔除包括分化的杂细胞,获得可以长期稳定维持多能干性的iPSCs。并对其细胞形态、标志性蛋白进行免疫荧光定位鉴定。使用特定培养基诱导已鉴定完全的iPSCs分化为间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC),并对其细胞形态、标志性蛋白进行流式细胞术鉴定。结果:(1)我们构建了4个第一代腺病毒载体,分别缩写为F35-EG,F11p-EG,HR-EG和CR-EG。所有载体均可以每个细胞500个病毒颗粒的感染复数(MOI)转导超过90%的K562或Jurkat细胞。除HR-EG外的所有载体均可以1000的MOI转导近90%的脐带血CD34+细胞或80%的原代人T细胞,并且F11p-EG显示出对F35-EG和CR-EG的轻微优势。腺病毒载体比CD8+T细胞更有效地转导CD4+T细胞。这些载体在高达1000vp/细胞的MOI下没有显示出细胞毒性,因为感染和未感染的T细胞保持相同的CD4/CD8比率和细胞生长速率。(2)成功分离获取MNC,并将携带四个重编程因子的仙台病毒载体导入淋巴细胞中,在预期的时间内出现了多个具有iPSCs形态的克隆。多次传代培养后,对其标志性蛋白(Nanog、Oct-4、Sox2、SSEA4)进行免疫荧光定位鉴定,结果显示均为阳性。对iPSCs诱导分化的MSC进行多个表面蛋白的流式细胞术鉴定,结果显示CD11b、CD19、CD34的表达均低于5%,CD73、CD90、CD105的表达均高于80%。结论:当人EF1a启动子用于控制转基因的表达时,HAdV-11p纤维假型HAdV-5可有效转导人T细胞,表明其可能在T细胞免疫治疗中应用。建立了血细胞诱导iPSCs以及iPSCs分化为MSC的实验体系,为进一步开展基因治疗相关研究提供了具有前沿性的模型。
【图文】：

穿梭质粒,启动子

图 1（A）携带人 EF1a 启动子的穿梭质粒的构建。（B）构建携带修饰纤维基因的骨架质粒。（C）纤维修饰的 HAdV-5 载体。所有载体含有插入 E1 区的相同的人 EF1a 启动子控制的 GFP 表达盒和不同修饰的纤维基因CMVp，CMV 启动子; C-RGD，RGD4C 与 HAdV-11p 纤维的 C 末端融合; EF1ap，人 EF1a 启动子; ES，封装信号; HI-RGD，RGD4C 插入 HAdV-11p 纤维旋钮的 HI 环; ITR，反向末端重复; Knob11p，HAdV-11p 光纤旋钮; Knob35，HAdV-35 纤维旋钮; MCS，多克隆站点; pA，SV40 polyA 信号; 轴 11p，HAdV-11p 纤维轴轴 35，HAdV-35 纤维轴; Tail5，HAdV-5 纤维尾部。3.2 转导造血细胞系选择 U937，K562，Jurkat 和 HL-60 的四种细胞系用于评估 4 种纤维修饰的HAdV-5 的基因转移能力。感染细胞并在 2 天后分析 GFP 荧光。 HL-60 是最不敏感的细胞系。当 MOI 增加至 500vp/细胞时，只有 44％的 HL-60 细胞可被 HR-EG感染。对于其他 3 种病毒，，感染效率低于 5％。尽管 HR-EG 是 HL-60 最有效的载体，但它是 U937 中最弱的载体。当以 100vp/细胞的 MOI 感染 HR-EG 时，35％的

转导,载体,纤维,细胞的

25图 2.通过纤维修饰的 HAdV-5 载体转导造血细胞系。用 MOI 为 100 或 500vp/细胞的腺病毒载体感染细胞，并在感染后 2 天用流式细胞术分析 GFP 表达。比较不同载体和细胞系中 GFP+细胞的百分比（A）和 GFP+细胞（B）的平均荧光强度。3.3 人 CD34 +脐带血细胞的转导从脐带血单核细胞中分离 CD34+细胞，并用 MOI 为 1000vp/细胞的 4 种载体感染。如图 3 所示，细胞纯度高（CD34+细胞超过 95％），基因转移效率可接受。HR-EG的效率最低，为55％，F35-EG的基因转移效率为88％，而F11p-EG和CR-EG的转录效率可高达 93％的 CD34+细胞。
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R450

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