弹状病毒科相关病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立和初步评价

发布时间：2020-04-04 21:56

【摘要】：目的:弹状病毒科病毒是一类具有广泛宿主的负链RNA病毒,其中包含数种对人致病的病毒,对公众健康带来严重威胁。建立灵敏、快速、准确的病毒检测方法对相关传染性疾病的诊断和防控有重要意义。鉴于此,本研究旨在建立针对弹状病毒科中对人致病的10种病毒的实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测方法,包括狂犬病病毒(rabiesvirus,RABV)、费兰杜病毒(Flanders virus,FLAV)、Hart Park病毒(Hart Park virus,HAPV)、Ekpoma-2病毒(Ekpoma virus-2,EKV-2)、Le Dantec病毒(Le Dantec virus,LDV)、Bas-congo病毒(Bas-congo virus,BASV)、Isfhan病毒(Isfhan virus,ISFV)、Chandipure 病毒(Chandipure virus,CHPV)、印第安纳水疱口炎病毒(vesicular stomatitis Indiana virus,VSIV)和新泽西水疱口炎病毒(vesicular stomatitis New Jersey virus,VSNJV),并进行初步的评价和应用。方法:1.下载所研究10种弹状病毒的基因序列并利用Clustal X 2.1软件进行比对,寻找RNA聚合酶蛋白基因(RNApolymerasegene,Lgene)保守区域,利用primerexpress3.0软件进行每种病毒的特异性引物、探针设计,以Geneious 11.0软件评价每种引物探针组合的发卡结构、引物二聚体等结构。利用primer-Blast对引物探针特异性进行初步评价。2.合成每种病毒包含靶基因的部分L基因于pGEM-t easy载体上,利用T7 RNA聚合酶体外转录制备每种病毒的RNA标准品。3.利用One-step PrimeScript RT-PCRKit(Perfect Real-time)试剂盒构建每种病毒的单重qRT-PCR反应体系,并通过改变退火温度、引物探针浓度优化反应条件,以Ct值最小、荧光强度最大时的条件为最佳反应条件。针对狂犬病病毒单重qRT-PCR,利用10倍系列稀释的己知病毒滴度的CVS-11病毒细胞培养上清评价其最小检测病毒滴度,与两步法、三步法巢式RT-PCR以及基于文献的N基因qRT-PCR的最低检测病毒滴度比较;并建立标准曲线,计算其线性范围、扩增效率和相关系数。利用10倍系列稀释的RNA标准品评价每种单重qRT-PCR最低检测核酸拷贝数量,并建立标准曲线,计算其扩增效率和相关系数。利用每种病毒的单重qRT-PCR对每种病毒的RNA标准品分别进行检测,确定各单重qRT-PCR之间是否发生交叉扩增反应。合成狂犬病病毒属中其他9种病毒的部分L基因,评价狂犬病病毒单重qRT-PCR的特异性。4.利用One-step PrimeScript RT-PCRKit(Perfect Real-time)试剂盒,以单重qRT-PCR体系的最佳反应条件,组装多重qRT-PCR体系。同样利用10倍系列稀释RNA标准品评价其最低检测病毒核酸拷贝数量,并建立标准曲线,计算其扩增效率和相关系数。通过对RNA标准品的重复检测,考察多重qRT-PCR的批内和批间重复性。5.为评价多重qRT-PCR的实用价值,用针对狂犬病病毒或其它弹状病毒的多重qRT-PCR分别对来自中国狂犬病病毒街毒株各个种群的13份鼠脑分离样本、43份待测脑组织临床样本和50份模拟血清样本进行检测,并将其结果与其它检测方法的结果进行比较。结果:1.通过126条狂犬病病毒基因序列比对,寻找到L基因7750-7895(CVS-11 GenBank No.GQ918139株病毒为参考序列)为保守区域设计上下游引物和探针;上下游引物探针与793条狂犬病病毒基因序列匹配,碱基差异个数均小于3个,保证扩增反应的顺利进行,无发卡结构、引物二聚体结构,引物探针的primer-blast分析结果中只包含狂犬病病毒基因序列。分别针对其他弹状病毒L基因保守区域设计出了引物探针,筛选出9组无发卡结构、无引物二聚体结构的引物探针组合,primer-blast分析结果中只包含待检病毒基因序列,与病毒序列完全匹配。2.己按照上述方法,制备每种病毒包含靶基因序列的部分L基因RNA标准品,测定每种标准品核酸拷贝浓度。3.选择引物浓度400nM、探针浓度350nM为最佳反应体系,以52℃C为RABBV、LDV、FLAV、HARV、EKV-2、BASV 6种病毒的单重qRT-PCR的退火温度,以55℃C为ISFV、VSIV、VSNJV、CHPV 4种病毒单重qRT-PCR的退火温度。狂犬病病毒单重qRT-PCR反应灵敏度评价结果显示最低检测病毒滴度为2.7×10-3 FFU/mL,在2.7X 107FFU/mL～2.7×102 FFU/mL之间呈线性趋势,可建立标准曲线,相关系数为0.9988,扩增效率为105.7%;灵敏度高于基于N基因的狂犬病病毒qRT-PCR(1 X 102倍),同时高于传统狂犬病病毒两步法巢式RT-PCR(1 × 102倍)和三步法巢式RT-PCR(1 X 104倍)。每种弹状病毒的单重qRT-PCR的最低检测核酸拷贝数量均为1 X 102 copies/μL,扩增效率均在90%～110%之间,回归系数均在0.99以上。特异性评价结果显示,狂犬病病毒qRT-PCR能够特异检测狂犬病病毒,对狂犬病病毒属的其他病毒没有扩增反应。各单重qRT-PCR反应之间没有交叉扩增反应。4.根据单重PCR最佳反应条件组装多重PCR反应体系,其中狂犬病病毒和LDV两种病毒组合为组A,FLAV、HARV、EKV-2、BASV四种病毒组合为组B,ISFV、VSIV、VSNJV、CHPV四种病毒组合为组C。印第安纳水疱口炎病毒和Chandipura病毒的多重qRT-PCR方法最低检测核酸拷贝数量为1 X 103copies/μL,针对其他病毒的多重qRT-PCR方法最低检测核酸拷贝数量为1 ×102copies/μL。批间、批内重复性评价结果显示,Ct值变异系数均在5%以下。5.针对标本的临床检测结果显示,狂犬病病毒单重qRT-PCR对覆盖我国狂犬病病毒街毒株6个种群的13个代表毒株均能够检出,待测临床样本检测结果与直接免疫荧光法检测结果完全符合。其他弹状病毒的多重qRT-PCR对模拟血清样本检测结果准确性为100%。结论:本研究建立了针对弹状病毒科中10种对人致病的病毒的单重及多重qRT-PCR检测方法,初步评价的结果表明,我们所建立的qRT-PCR检测方法灵敏度高,特异性强,且稳定性强,能够在1×108copies/uL～×102copies/uL范围内对核酸样本中病毒核酸拷贝数量进行绝对定量检测。狂犬病病毒单重qRT-PCR能够对病毒滴度在2.7X 107FFU/mL～2.7X 102 FFU/mL之间病毒样本的病毒滴度进行定量检测。狂犬病病毒qRT-PCR检测与其他病毒的多重qRT-PCR临床样本检测结果准确性为100%。综上所述,本研究建立了一种针对弹状病毒科中对人致病病毒的灵敏、特异、快速的实时荧光定量RT-PCR检测方法,该方法的建立和推广可为相关传染性疾病的诊断和防控奠定基础。
【图文】：

弹状病毒,颗粒结构

中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所逦硕士学位论文逡逑共同构成了核糖核蛋白（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ，ＲＮＰ）邋［８］。Ｍ蛋白位于膜下方，其功能包括与病逡逑毒核衣壳、脂质膜和Ｇ蛋白的尾区（ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃｔａｉｌｓ）相互作用组装病毒粒子，维持病毒颗逡逑粒的紧密结构，并介导病毒从细胞中出芽释放Ｇ蛋白为跨模型整合蛋白，形成三聚体逡逑结构，构成病毒粒子的外表面，负责与宿主细胞受体结合，是宿主体内中和抗体的靶标［１２］逡逑（图２所示）。逡逑

示意图,原理,示意图,产物

逡逑ＤＮＡ结合荧光染料能够与扩增产物结合，从而在扩增过程中产生荧光（图４）。染料同逡逑时能够与非特异性产物结合，因此在ＰＣＲ扩增结束以后进行熔融曲线分析，以区分特异性逡逑产物和非特异性产物。逡逑５邋ＳＹＢＲ邋ｇｒｅｅｎ邋Ｉ逦逦逡逑0逡逑０0０0０逦一逦ｉ逦0逡逑ｆ邋逦邋？？？？？－逦逦逦逡逑Ｏ逦？邋｜邋＼邋？邋｜邋＼逡逑图４．荧光染料法原理示意图＾逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋４．邋Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ邋ｄｉａｇｒａｍ邋ｏｆ邋ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ邋ｄｙｅ邋ｍｅｔｈｏｄ逡逑探针法只能够检测特异性扩增产物，因此在近年来应用范围逐渐扩大，其中ＴａｑＭａｎ探逡逑针是当前使用最广泛的水解荧光探针，同时可以在不同的探针上标记不同的荧光分子，建逡逑立多重荧光ＰＣＲ来对病毒进行分型检测（图５）。可以在荧光标记探针上标记核苷酸类似逡逑物，如邋ＬＮＡ邋（ＬｏｃｋｅｄＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ，，锁定核酸）、ＰＮＡｓ邋（Ｐｅｐｔｉｄｅｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｓ）、ＺＮＡ邋（Ｚｉｐ逡逑ｎｕｃｌｅｉｃ邋ａｃｉｄｓ）等，提升探针Ｔｍ邋（Ｍｅｌｔｉｎｇ邋Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）值，因此可以将探针设计的很短。逡逑实时荧光定量ＰＣＲ在临床快速诊断、治疗效果的监测和评估、发现传染源、疾病流行暴发逡逑的处置等临床和公共卫生领域广泛应用。逡逑１８逡逑
【学位授予单位】：中国疾病预防控制中心
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R511;R440

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