基于生物质谱的血清N-聚糖分析以及新型生物标志物研究

发布时间：2020-04-07 15:52

【摘要】：糖基化是一种常见的蛋白质翻译后修饰,广泛参与各项生理活动,如蛋白质折叠、细胞通讯、肿瘤转移、免疫识别以及微生物入侵等,越来越多的临床研究证据表明许多疾病或非正常的生理状态下,一个或多个蛋白质的糖基化程度和其对应糖链结构会发生改变。而对这些变化进行测定,不仅可以了解某些蛋白质的生理功能并且可以用于疾病的诊断。因此,通过研究N-聚糖的结构及含量的变化来寻找可能的生物标志物已成为当前糖组学研究领域的热点之一。由于来源广泛,易于获取及富含多种不同类型糖蛋白,血清是目前糖组学研究最多的样品体系。但是由于血清样品自身组成复杂性,以及蛋白质糖基化性质导致其相对应的聚糖结构的多样性和微观不均一性,给血清中低含量N-聚糖的结构及定量分析带来困难。相较于传统的分析方法,生物质谱法具有高灵敏度、高通量和抗杂质干扰等优点,已成功应用于血清糖组学的研究。但这些基于生物质谱的分析方法依然不太完善,例如糖链的富集、纯化、标记等,仍需进一步的研究。本文利用生物质谱的优势,采用两种衍生化技术,首次对豚鼠血清N-聚糖的结构进行了系统研究,并对几种分析方法进行了比较。将优化后的分析方法应用于结直肠癌病人血清及环境污染物影响人群血清中Ig G的N-聚糖变化研究,找到潜在的生物标志物。具体内容如下:豚鼠作为一种重要的模式生物,常被应用于免疫学,毒理学和药理学等领域方面研究。针对豚鼠血清中N-聚糖进行分析有助于进一步了解其生理功能。为了增强N-聚糖的质谱响应信号,我们对豚鼠血清中N-聚糖分别进行全甲基化和甲胺化衍生,然后通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-MS)鉴定了31种全甲基化N-聚糖结构和43种甲胺化N-聚糖结构。首次发现豚鼠血清中的唾液酸化聚糖的唾液酸存在O-乙酰化现象。结果表明温和甲胺化衍生不破坏O-乙酰化唾液酸结构,更适用于唾液酸化聚糖的分析。同时基于纳流液相和电喷雾电离质谱联用(nano LC-ESI-MS)鉴定出54种甲胺化的N-聚糖结构及其相对应的200多个甲胺化的N-聚糖异构体,并通过二级质谱对其结构进行确认。实验发现O-乙酰化不仅仅能影响N-聚糖同分异构体的数量,而且还能在一定程度上改变该N-聚糖的亲疏水性。实验结果表明尽管nano LC-ESI-MS在鉴定N-聚糖的结构更具优势,但是MALDI-MS由于操作简便,图谱易解析,更加适合大规模血清样品中N-聚糖分析。结直肠癌是全球发病率和死亡率排在前三位的常见的消化道恶性肿瘤,因此结直肠癌的临床诊断变得尤为重要。本章采用上一章建立的MALDI-MS方法对健康人群和结直肠癌病人的血清中的N-聚糖进行分析,其中准确鉴定出64种人血清N-聚糖结构。所得到的质谱数据经归一化处理后,再通过过t检验和受试者工作特征曲线可以确定其中3种带有核心岩藻糖结构的N-聚糖与结直肠癌密切相关,可以作为良好的结直肠癌标志物。此外,在对癌症期型分类与N-聚糖变化关系研究中,发现血清中N-聚糖在结直肠癌I期的变化并不明显,而在结直肠癌II期、III期和IV期的变化比较显著,从糖组学的角度佐证了为什么结直肠癌早期不易被诊断。上述结果表明将MALDI-MS应用于筛选N-聚糖标志物,不仅能够准确鉴定N-聚糖结构并且获取相应的疾病标志物,还能从机制上了解疾病的发展。全氟辛烷磺酸盐(PFOS)和全氟辛酸(PFOA)是两种广泛存在于自然环境中常见的有机污染物,均能引起人体出现不良免疫反应,如胸腺细胞和脾细胞数量减少、肝脏增重以及过氧化物酶体增值等。免疫球蛋白(Ig G)是免疫系统主要的功能执行者,Ig G的糖基化与许多疾病的发生和发展密切相关。因此,本章从糖组学的角度,探讨Ig G糖基化与不同浓度的PFOS和PFOA在不同人群中的相互作用关系。采用MALDI-MS技术结合甲胺化衍生方法,对受PFOS和PFOA影响的95个成人和95个儿童血清中提取的Ig G的N-聚糖进行研究,鉴定出28种源于Ig G的N-聚糖结构。质谱数据处理与统计分析显示,成人组有11种跟PFOS和PFOA浓度相关的具有显著性变化的N-聚糖,而少年组中则出现了12种跟PFOS和PFOA浓度相关的具有显著性变化的N-聚糖。就N-聚糖结构特征而言,成人组主要表现为高甘露糖基化,岩藻糖基化和唾液酸化程度的变化,而少年组则主要表现为岩藻糖基化和唾液酸化程度的变化。由此可见,PFOS和PFOA的存在与Ig G糖基化密切相关。本章首次从糖组学的角度来揭示PFOS和PFOA对不同人群会产生不同的影响,在发现与PFOS和PFOA浓度变化具有显著性相关性的Ig G N-聚糖结构的基础上,可以在一定程度上诠释PFOS和PFOA与不同人群人体免疫系统响应的关系。综上所述,本文将质谱检测技术应用于生物体内的血清N-聚糖系统性研究,首次获得了豚鼠血清N-聚糖的完整信息,同时还发现了极具潜力的结直肠癌N-聚糖标志物,并且首次将糖组学的研究方法应用于分析环境污染与健康的问题,为更加深入的了解环境污染的机制提供了新的思路。本论文工作的开展为将来在临床疾病诊断、药物开发以及公共卫生领域提供技术手段与理论基础,具有广阔的应用前景。
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R446.1

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本文编号：2618094