异烟肼耐药相关基因联合突变对耐药表型的影响

发布时间：2020-04-09 16:49

【摘要】：结核病(Tuberculosis,TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)引起的呼吸道传染病,严重地影响人类健康。2018年结核病全球报告显示,2017年估算的新发结核病例为1000万例,约有160万人死于结核病,55万人发展为耐多药结核(MDR-TB,同时对异烟肼和利福平耐药)。中国是第二大结核病高负担国家,同时也是耐药结核病例最多的国家之一。世界卫生组织提出“2035年终结结核病”的目标,所面临的最大挑战来自耐药结核的出现和传播。快速、准确的耐药结核菌鉴定可以为制定有效治疗方案提供依据,从而减少耐药菌的产生。耐药结核菌的鉴定主要有药敏实验和分子生物学诊断,相比于以培养为主的药敏实验,分子生物学诊断以耐药相关基因突变位点的检测为基础,具有操作简便、灵敏、快速等优点,越来越多的应用于耐药结核病的临床诊断。目前,分子生物学诊断所面临的问题有:针对某些药物,基因突变与耐药表型联系不确定,耐药突变涉及多基因、多位点,联合基因突变与耐药表型的关系不明确等。异烟肼(Isoniazid,INH)是重要的一线抗结核药物,是WHO推荐的DOTs治疗药物,同时,还可用于结核潜伏感染的预防性治疗。INH耐药涉及Mtb的多个基因,目前已知INH耐药相关基因有20个,包括代谢酶活性、细胞壁合成和外排泵相关的编码和调控基因。由于常规PCR扩增获得基因信息量有限,以往研究文献报道主要集中在部分基因和高频突变位点,如,katG315和inhA启动子区-15突变。同时,样本数量和代表性的限制,针对其他出现频率较低的INH耐药相关基因突变信息较少,目前还没有针对临床菌株进行系统、完整的对报道的所有已知INH耐药相关基因突变情况的研究。本课题应用高通量基因组测序方法,对我国临床分离株中INH耐药相关基因突变情况进行了全面、系统的分析,同时结合菌株的耐药程度结果,重点聚焦多基因联合突变对INH耐药进化的影响。在对近期全国耐药基线调查中收集的来自全国31个省72个采样点的菌株样本库中随机抽取的201株结核分离株(包括168株MDR-TB、20株INH单耐药和13株敏感株)进行全基因组测序和生物信息学分析,获得每个菌株中20个基因的INH耐药相关基因突变信息。同时,通过INH最小抑菌浓度(MIC)测定,获得菌株的耐药程度结果。分析结果显示:1)发现有96.8%(182/188)INH耐药临床分离株检测到INH耐药相关基因发生突变,有18个结构基因和2个启动子区检测到发生突变,未检测到突变的基因有accD6和fabG1,在这些突变类型中katG、inhA/inhA-P和ahpC/ahpC-oxyR区域的突变比例最高,分别占 85.7%(162/188)、21.8%(41/188)和18.6%(35/188),其他基因的突变频率在0.53%-4.26%之间;2)针对katG基因,除检测到三种katG315突变(占耐药株51.6%(97/188))外,还检测到56种非315位点突变(占耐药株45.21%(85/188)),其中有23种为首次报道;3)在我国出现的INH耐药基因突变分化程度高,共检测出96种突变组合,包括单基因突变为28种,多基因联合突变为68种,分别占耐药菌株的51.60%和45.21%;4)联合突变主要表现为katG的联合突变,包括katG315联合突变和katG non315联合突变。菌株表现为高耐药程度的联合突变包括katG 315和inhA-P联合突变,katG non3tG和ahpC-oxyR联合突变。我们的结论是,在我国临床分离的INH耐药菌株中基因联合突变比较普遍,其中katG315和inhA-P以及katG non315和ahpC-oxyR基因联合突变与高INH耐药水平有关。此外,katG315位点在MDR-TB菌株中的突变率为54.76%,提示我们针对katG315位点的INH耐药分子诊断试剂检测并不能满足临床需求。本课题通过对结核耐药菌INH耐药相关基因的联合突变和表型耐药程度的联合分析,为深入了解INH耐药机制提供了参考信息,为建立更灵敏的INH检测提供了数据支持。
【图文】：

与活化的ＩＮＨ形成一个三元络合物，它能作用于某些酶，影响分枝杆菌细胞壁的合逡逑成，例如，饱和酶、环丙烷酶或参与脂肪酸延伸的酶抑制ＭＡ和细胞壁的合成，，导逡逑致结核菌的耐酸性丧失，从而杀死细菌＿邋（如图１－丨）。逡逑ＩＮＨ逡逑Ｓｉｍｐｌｅ邋ｐａ？？ｖｅ邋ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ逡逑．逦ｉ邋—逦．．．逡逑ＩＮＨ邋Ｓｕｓｃｅｐｔｆｂｉｅ邋ＴＢ邋ｂａｃｉｌｌｉ逡逑ＩＮＨ逡逑，Ｋ？ｔＧ逦丨＿逡逑？邋Ａｃｔｒ＼？邋ｐｒｏｄｕｃｔ邋？逡逑？逦ｔＮＨ＊逡逑Ｈ，０＊０－逦：逦－逦ＮＡＤＨ逡逑ＩＮＡＤＨ＊逡逑？ｍｔｔ＜邋？ｔｏｎｆＭｉｏｎ邋ｏｆ逡逑ｌｗｔ＞邋＊ＯＯｉ逡逑ｉ逡逑ｉｎｈｔＭｔｔ邋ｃａｌｌ邋ｗａｌｌ逡逑ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ逡逑Ｋｉｌｌｓ邋Ｂａｃｉｌｌｉ逡逑图１－１：异烟肼杀菌作用机制（参考文献…】）逡逑１１逡逑

／Ｍ．４编码区发生了邋Ｓｅｒ９４邋Ａｌａ替换，这种突变结合了邋ＩＮＨ和ＮＡＤＨ复合物，导致逡逑了邋ＩｎｈＡ蛋白的构象变化，且目前有针对该位点突变的ＩＮＨ耐药诊断试剂据不逡逑完全统计，目前发现的结构区ａａ突变有９种（如图１－４）。研究还发现，／？／以－户逡逑（／＇／仇４的启动子区）突变与ＩＮＨ耐药有关，在ＩＮＨ耐药菌株中检测到５种突变类逡逑型，其中Ｃ邋（－１５）邋Ｔ、Ｔ邋（－８）邋Ｇ／Ａ和Ａ邋（－１６）邋Ｇ这３个位点突变使ＩｎｈＡ蛋白过逡逑度表达，从而导致低水平ＩＮＨ耐药据报道，结核菌ＩＮＨ耐药产生不仅依赖于逡逑药物作用靶点或结合位点的突变，还有依赖启动子区点突变导致耐药，如／ｎ／ｄ－／１突逡逑变导致编码的酶的过度表达，从而对ＩＮＨ产生耐药【５｜】。逡逑Ｉ邋／Ｉ邋／｜邋－？！邋－邋２邋２邋０邋ａ邋ａ逡逑＜邋邋１邋邋＂逦．邋■邋邋逦邋—．邋ｉ邋，逦逦逡逑（ＴＯ）逦（ｊ＾）逡逑逦逦！逦邋—邋逦逦逡逑；邋］逡逑（￡－９逦？逡逑图］－４：邋／ｎ／７，４基因ａａ突变及分布图逡逑１３逡逑
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R446.5;R52

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本文编号：2621012