展示Fba1表位的杂合噬菌体应用于白色念珠菌感染预防和检测的研究

发布时间：2020-04-09 22:13

【摘要】：白色念珠菌是一种条件致病真菌,通常寄生于人的呼吸道、肠道及阴道等粘膜系统中,在免疫力低下的人群中,如癌症患者、艾滋病患者、长期服用广谱抗生素病人、器官移植病人等,可引发不同程度的白色念珠菌感染,甚至引发系统性白色念珠菌感染。白色念珠菌感染无显著临床病征,且极易产生抗药性,使其早期诊断和治疗变得困难,死亡率居高不下,是癌症患者等免疫力低下病人死亡的重要原因之一。临床数据显示,白色念珠菌感染已经成为医院血液感染死亡的第二常见死因。降低白色念珠菌感染死亡率的一个有效途径是提前预防、早诊断、早治疗,但目前尚缺乏有效的预防和早期诊断试剂,临床应用的血培养检测方法灵敏度低,耗时长,往往延误病人的最佳治疗时期,因此,开发一种白色念珠菌感染的疫苗和早期诊断试剂具有重要的临床意义。噬菌体展示技术是通过改造噬菌体基因组,将外源多肽融合表达于噬菌体颗粒表面的一项技术。该技术在研制检测试剂、新疫苗开发和药物制备等方面具有广泛的应用,为现代医学的发展提供了新的手段和方法。丝状噬菌体是一种良好的疫苗和诊断试剂的载体,具有很多优点:首先,丝状噬菌体对人和动物等真核生物无毒性,且作为天然的大分子,可诱导机体产生强烈的免疫应答,使接种疫苗时可省略副作用较大的佐剂。其次,抗原表位被充分地以多拷贝的形式展示在噬菌体表面,且保持天然构象,更容易被接触到,产生强烈的抗原-抗体反应。最后,丝状噬菌体制备简单,易于改造,理化性质稳定,适合大批量生产,且生产成本和耗时都大大低于传统疫苗和诊断试剂的制备。鉴于此,本论文以噬菌体展示技术为基础,针对白色念珠菌感染的预防和早期诊断进行了如下两方面的研究:1.展示Fba1表位的单展示噬菌体应用于白色念珠菌感染预防的研究本部分研究利用丝状噬菌体展示技术将白色念珠菌的免疫优势抗原Fba1的一个有效表位分别展示在丝状噬菌体fd的pIII和pVIII外壳蛋白表面,构建成两种单展示噬菌体,并用Western Blot技术对他们的免疫原性进行验证,以及通过免疫小鼠,构建白色念珠菌感染小鼠模型的方法探索他们对白色念珠菌感染的保护能力。实验结果表明,两种展示Fba1表位的单展示噬菌体均可被Fba1多克隆抗体识别,具有免疫原性,且均能刺激小鼠产生体液免疫应答和细胞免疫应答,降低小鼠肾脏真菌定殖量,减轻肾脏损伤,增加小鼠存活率。2.癌症患者血清中白色念珠菌相关抗体的检测在本部分研究中,我们构建了同时展示Fba1表位和Hsp90表位的双展示噬菌体,并以展示Fba1表位的两种单展示噬菌体、展示Hsp90表位的单展示噬菌体,以及Fba1和Hsp90重组蛋白为对照,对癌症患者(白色念珠菌易感人群)血清和健康人血清进行间接ELISA检测。实验结果表明,展示抗原表位的单展示噬菌体和重组蛋白之间的检测效果无显著差异,但是同时展示Fba1和Hsp90两种抗原表位的双展示噬菌体可以显著的提高检测的灵敏性。此外,我们还结合胶体金侧向层析技术,以Fba1重组蛋白为捕获抗原,建立了一种白色念珠菌感染的快速诊断方法,通过对白色念珠菌易感人群癌症患者血清和健康人血清进行检测,发现了该方法灵敏性和特异性与间接ELISA法相似,但是极大的缩短了检出时间。综上所述,本研究利用噬菌体展示技术,构建了展示白色念珠菌Fba1有效表位的噬菌体,发现了其在白色念珠菌感染的预防和早期诊断中具有一定的应用价值,为真菌感染新型疫苗和诊断试剂的研发开辟了新思路。
【图文】：

白色念珠菌,假菌丝,形态

前言1. 白色念珠菌的危害1.1 白色念珠菌简介白色念珠菌（Candida albicans）又叫白假丝酵母菌，是一种酵母型真菌，为念珠菌属。白色念珠菌具有多种形态，以酵母体和菌丝体形态为主，假菌丝形态出现较少。酵母体细胞形态与酿酒酵母细胞相似，呈圆形或卵圆形，直径约 3～6 μm，革兰氏染色为阳性，但着色不均匀。菌丝体形态是细胞生长出管状菌丝菌丝两边完全平行伸长。假菌丝形态是细胞以出芽方式繁殖，芽生孢子伸长形成芽管，芽管不与母体分离，进而形成的假菌丝。假菌丝细胞之间有明显的缢缩易形成分支（图 I）[1, 2]。白色念珠菌酵母体形态一般没有致病能力，细胞体积较小，易于在血液中传播，而菌丝体形态具有较强的致病能力，，可侵入粘膜或深层组织，引发白色念珠菌感染[3, 4]。

模式图,白色念珠菌,侵染,模式图

物中占比高达 75%[20]，其中以白色念珠菌为主[21, 22]，鹅白色念珠菌引起的口腔念珠菌感染。此外，调查显示，大至少有一次阴道念珠菌感染，其中部分女性会经历复发性珠菌感染具有较高的发病率和死亡率，临床统计数据显示感染是由白色念珠菌引起的[27-29]，即使接受治疗，其死亡值得注意的是，随着广谱抗生素[32-41]和免疫抑制剂的广泛癌症患者、器官移植患者、免疫功能低下患者等易感人群性白色念珠菌感染发病率仍在逐年增加[42-45]。菌感染的预防机制及其疫苗研究现状菌感染预防机制动侵染机体主要包括黏附[46-48]、形态转变[49, 50]、分泌毒细胞等过程（图 II）[54, 55]，期间，白色念珠菌还通过影响抑制INF-γ、IL-2和IL-17的表达来增强自身的侵染能力
【学位授予单位】：东北师范大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R519.3;R446.5

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