铜绿假单胞菌菌毛蛋白PilA诱导IL-1β产生的初步研究

发布时间：2020-04-16 00:32

【摘要】：目的:研究铜绿假单胞菌菌毛蛋白PilA的C端部分碱基是否对PilA诱导IL-1β产生具有重要影响,为阐明PilA诱导IL-1β产生的关键氨基酸位点提供基础,以期最终能为研发新药提供准确的靶点。方法:1、根据铜绿假单胞菌模式菌株PAO1的菌毛蛋白基因pilA的序列,通过PCR扩增pil A和其C端缺失124bp的片段,再将PCR扩增片段连接到质粒pET-41a(+)上,将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,利用IPTG诱导,使之表达出全长PilA蛋白(PilA-FL,含GST标签蛋白)和C端部分缺失(缺失124bp)的PilA蛋白(pilA~(108),含GST标签蛋白)。同时将空质粒PET-41a(+)转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,利用IPTG诱导,使之表达出GST标签蛋白。将这三种蛋白(GST标签蛋白、Pil A-FL、pilA~(108))经GST亲和层析,得到纯度较高的可溶性目的蛋白。2、利用脂质体转染法将PilA-FL、pilA~(108)和GST标签蛋白转染小鼠巨噬细胞RAW264.7,同时设空白组(细胞培养基中不含血清及抗生素)、对照组(在不含血清及抗生素的细胞培养基中加脂多糖(LPS)和脂质体)、蛋白转染组(GST标签蛋白组、PilA-FL蛋白组、pilA~(108)蛋白组,在这些蛋白组中加与对照组相同的培养液,同时加0.15μg相应的蛋白),在培养期间(6h、12h、24h、48h、72h),用倒置显微镜观察每组细胞形态的变化。3、在不同的时间点(6h、12h、24h、48h、72h),分别取各实验组的细胞培养液,经离心取上清液,用ElISA法检测IL-1β产生的含量。结果:1、成功构建了两种重组质粒,将空质粒PET-41a(+)和重组质粒分别转化到BL21(DE3)中,经诱导表达及纯化,最后得到纯度较高的可溶性目的蛋白:GST标签蛋白、PilA-FL蛋白和PilA~(108)蛋白。2、随着时间的变化(6h、12h、24h、48h、72h),空白组巨噬细胞形态变化不明显,但对照组及蛋白转染组细胞均发生明显改变。对照组及蛋白转染组在同一时间点与空白组比较,在6h时细胞就开始有了炎症变化,胞质内出现空泡和中毒颗粒,随着时间的增加细胞的炎症变化越来越严重,胞质内空泡和中毒颗粒不断增加、且在48h最为典型,在72h细胞已开始退化。3、在6h、12h、24h、48h、72h,对照组及蛋白转染组中IL-1β含量明显高于空白组,差异有统计学意义(P0.05);蛋白转染组中IL-1β含量明显高于对照组,差异有统计学意义(P0.05);PilA-FL蛋白组和Pil A~(108)蛋白组中IL-1β含量明显高于GST标签蛋白组,差异有统计学意义(P0.05);PilA-FL蛋白组和Pil A~(108)蛋白组相比IL-1β含量没有明显差异(P0.05)。结论:1.在加入LPS刺激巨噬细胞6h时,细胞炎症模型已经成功构建;2.PilA蛋白C端去除的124bp对PilA蛋白诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7产生IL-1β可能没有重要影响;3.铜绿假单胞菌菌毛蛋白诱导IL-1β产生的关键氨基酸位点可能不在PilA蛋白基因C端的124个碱基之中。
【图文】：

氨基酸序列,菌毛蛋白,二级结构

图 1 菌毛蛋白 PilA 二级结构成熟 PilA 蛋白的 N 末端有 35 个氨基酸序列是高度保守的[9]，此区被认为是PilA 蛋白之间相互作用的区段，使菌毛蛋白连接形成螺旋四级结构。相比之下，其余的氨基酸序列不太保守，尤其是 D 区。PilA 蛋白可通过其 D 区及附近区段结合真核细胞膜糖脂受体 asialo-GM1 (neutral glycolipidgangliotetraosyl-Ceramide)[10]，此区段被称为 C 端受体结合域，该域位于菌株 PAK的菌毛蛋白 C 端第 128-144 氨基酸残基之间，相当于 PAO1 菌株的 133-149 个氨基酸残基。菌株 PAO1 中 PilA 的 C 端受体结合域单点突变 K130I 后，菌毛不能结合不锈钢，而对人类的口腔上皮细胞的结合则增强。因此，C 端受体结合域的变化对菌毛与不同表面的结合具有重要作用。PilA 蛋白含有 KSTQD 模体[11]，位于靠近 C 端的 D 区（在菌株 PAO1 中，是 PilA 从 N 端到 C 端的的第 135-147 个氨基酸残基），KSTQD 模体也存在于

产物,硕士学位论文,医学院,电泳分析

义医学院硕士学位论文潘兴国结果.1 目的基因扩增片段大小鉴定如下图所示：目的基因片段在 PCR 仪中进行扩增后，利用琼脂糖凝胶进电泳分析，，PilA-FL PCR 产物应为 360bp，PilA108PCR 产物应为 236bp，由图知， PCR 产物实际电泳出来的条带与设计时的大小吻合。
【学位授予单位】：遵义医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R446.5

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