HIV感染者抗病毒治疗后免疫恢复与单核细胞炎性反应的相关性及调控研究

发布时间：2020-04-21 02:01

【摘要】：目的:获得性免疫缺陷综合症(Acquired Immune Deficiency Syndrome,AIDS)是由人类免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus,HIV)引起的一种传染性疾病,抗逆转录病毒治疗(Antiretroviral Therapy,ART)的出现大大降低了HIV感染者的发病率和死亡率,但在ART治疗后免疫恢复情况在HIV感染人群中存在很大差异,大多数人在治疗后1-2年免疫系统功能得到一定程度恢复,CD4+T细胞水平明显升高,病毒载量得到有效控制,称免疫应答者(Immunological Responders,IR)。但有些患者在抗病毒治疗后1-2年甚至更长的时间,免疫细胞的功能未得到有效恢复,CD4+T细胞水平无明显升高甚至降低,病毒载量未得到有效控制,称为免疫无应答者(Immunological Nonresponders,INR),免疫无应答者的发病率及死亡率远远高于应答者,为改善艾滋病抗病毒治疗效果,降低病死率,明确免疫无应答机制对疾病转归具有重要意义。HIV感染后肠道上皮细胞损伤和大量微生物移位,引起免疫系统的持续性活化及高炎性应答状态是导致HIV感染疾病进展和预后不良的重要原因。目前,抗病毒治疗虽然能够降低炎性反应,但不能将其控制在正常水平,炎性因子持续分泌,导致免疫细胞的衰老和耗竭,影响抗病毒治疗效果,降低HIV感染者的生活质量。研究显示,抗病毒治疗后持续炎症状态是免疫无应答的重要原因,探索INR的免疫机制,深入了解炎症应答过程中免疫细胞的调节机制有助于控制机体过度炎症反应状态,为HIV功能性治愈的提供新的治疗靶点。单核细胞作为HIV感染后参与免疫应答的关键免疫细胞,在HIV抗病毒治疗后IR、INR的单核细胞亚群分布目前尚无报道。单核细胞发挥炎性应答需要大量的能量供给,活化后其代谢状态由有氧氧化向糖酵解转变,而异常的糖代谢状态是影响HIV疾病进展与转归的重要因素。葡萄糖转运蛋白(Glucose transporter 1,Glut1)是细胞糖代谢的关键分子。因单核细胞在HIV感染后长期处于慢性活化状态,糖摄取增加,研究显示,HIV感染后Glut1在单核细胞表面表达增加,ART治疗后未恢复至正常水平,但Glut1在INR、IR单核细胞各亚群的表达情况尚无报道。本研究首次对ART后免疫恢复效果不同的患者单核细胞亚群分布及Glut1的表达情况进行分析,探索单核细胞表面Glut1与免疫恢复的关系以及对炎性因子分泌的影响。机体免疫系统中,炎性细胞因子的主要来源是单核巨噬细胞系统,同时炎性因子的分泌是单核细胞发挥炎性应答的重要手段。IP-10是一种干扰素诱导蛋白(Interferon-inducible protein-10,IP-10),由单核细胞、巨噬细胞、血管内皮细胞等分泌的促炎性细胞因子。HIV感染后IP-10的分泌明显增加,血浆IP-10浓度不仅与HIV感染早期疾病快速进展有关,与机体持续的免疫活化也密切相关。另外IP-10作为HIV感染的标志性因子,血浆中高水平IP-10是单核细胞发挥炎性应答的重要途径。明确IP-10的调控机制,有效控制单核细胞的炎症应答及IP-10分泌,对于探索新的干预手段和治疗策略具有重要意义。免疫系统的异常活化以及某些炎症因子的过度分泌与INR有关,单核巨噬细胞系统是炎性因子的主要来源,探索单核细胞炎性反应的影响因素,有助于深入了解HIV免疫恢复的调节机制,为控制机体过度炎症应答提供新思路。研究方法:1.研究对象论文第一部分共收集28例样本,HIV感染者19例,治疗时间为18-24个月,治疗前CD4+T细胞数:200 500 cells/μL,筛选出HIV感染抗病毒治疗后免疫应答者(IR,n=9)治疗后检测点的CD4+T细胞数高于治疗前(30%),免疫无应答者(INR,n=10)治疗后检测点的CD4+T细胞数低于治疗前(20%),呈不断降低的趋势,或经治疗后CD4+T细胞无明显的增加。健康对照(Healthy Control,HC,n=9)。论文第二部分共申请HIV感染者(HIV,n=32)和健康对照(HC,n=35)共67例血浆样本,冻存于-80℃。2.原代细胞的分选和单核细胞亚群检测密度梯度离心法提取外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC),首先提取全血的PBMC,采用BD FACS Aria流式细胞仪分选以CD14(PE-Cy7)和CD16(APC-Cy7)两抗体将单核细胞分为三个亚群,classical[C]:CD14++CD16-,intermeidate[I]:CD14++CD16+,nonclassical[NC]:CD14+CD16+。4℃避光染色30min,离心洗涤细胞,弃上清,使用流式细胞仪LSRⅡ及Flowjo软件(BD)进行单核细胞亚群和Glut1(PE)(RD Systems)表达的分析。3.THP-1细胞的培养及THP-1-MA的诱导培养人单核细胞白血病细胞株(THP-1)培养于含有10%FBS的RPMI 1640(HyClone)。佛波酯(phorbol 12-myristate 13-acetate,PMA,100 ng/m L;Sigma)处理THP-1细胞48h,诱导THP-1分化为THP-1 macrophage(THP-1-MA)。4.转染siRNA将siRNA-Glut1(20μM,Invitrogen)转染至THP-1细胞中,转染试剂为(HiperFect Transfection Reagent,Qiagen),48h后脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS;1ug/ml;Sigma)刺激24h,收集细胞和上清。细胞和上清分别用于检测Glut1的敲除效率和单核细胞分泌相关细胞因子的变化。THP-1细胞经PMA处理48h后转化为THP-1-MA,ISG15的敲除采用siRNA-ISG15(20μM,Invitrogen),孵育24h后转染mimics/control,转染试剂为(Hiper Fect Transfection Reagent,Qiagen),48h后LPS刺激24h,收集细胞和上清。细胞和上清分别用于检测Glut1的敲除效率和单核细胞分泌相关细胞因子的变化。siRNA阴性对照为非特异性Stealth RNAi?Negative Control Duplexes。5.转染miRNA mimics,inhibitors将miRNA的mimics和inhibitors(20μM)和阴性对照(control)(GenePharma)用HiperFect转染试剂(Qiagen)转染至THP-1,孵育48h后,LPS刺激24h(1ug/ml;Sigma)。收集细胞用于miRNA和mRNA提取,上清用于IP-10浓度的检测。6.逆转录和荧光实时定量PCR提取miRNA用miRNeasy Micro kit(Qiagen)。总RNA提取采用RNeasy Micro kit(Qiagen),为防止基因组DNA污染,RNA提取后采用DNase I进行纯化。逆转录试剂Primpscript?RT reagent kit(TAKARA)将RNA逆转录。检测mi RNA和mRNA相对表达量的实时荧光定量PCR采用SYBR?premix ExTaq?II试剂(TAKARA)。所有的引物序列见表3。miRNA相对表达量内参基因为small nucleolar RNA(snRU6),mRNA内参基因为GAPDH。mi RNA和mRNA相对表达量的计算采用2~(-ΔΔCt)法。7.检测细胞上清及血浆中细胞因子稀释标准品、磁珠、抗体及生物素。在96孔检测板中加入50ul磁珠,洗板3次后,加入50ul标准品或血浆,高频震荡摇床室温避光孵育1h,洗板3次后加入25ul抗体,同样震荡避光室温孵育1h,洗板3次后加入50ul SA-PE,避光15min,最后加入125ul Assay buffer,避光孵育后上机检测(Bio-Plex2000,Bio-Rad)。8.IP-10检测收集HIV感染者和健康对照血浆和细胞培养上清,IP-10检测采用ELISA试剂盒(RD Systems)。通过绘制标准曲线,乘稀释倍数,计算IP-10浓度。9.荧光素酶报告基因检测根据靶基因预测,IP-10的3'UTR有两个miR-21结合位点(nt 196-202,235-240)。将包含miR-21结合位点的IP-10 3'UTR片段插入GP-miRGLO载体(GenePharma)。293T细胞于转染前一天接种至48孔板,用转染试剂Lipofectamine2000 reagent(Invitrogen)共同转染连接有目的片段的荧光素酶报告基因载体和miR-21 mimics/inhibitors(20μM)。为了检测两结合位点是否均发挥生物学效应,分别将IP-10 3'UTR野生型,两位点的突变序列插入报告基因载体:突变位点1(mut-1),突变位点2(mut-2)。共同转染miR-21和空载质粒(GP-miRGLO),插入野生型的IP-103'UTR和mut-1/mut-2,24h后收集细胞,用Dual-Luciferase Report Assay(Promega)裂解细胞并检测萤火虫和海肾的荧光强度,进行分析。10.统计分析GraphPad Prism软件用于统计分析和制图,miRNA和mRNA相对表达水平及si-Glut1后细胞上清中细胞因子的浓度比较采用非配对t检验。非参数Mann-Whitney U检验来统计HIV患者和HCs血浆中细胞因子的差异。用Spearman相关系数分析各变量之间的相关性,P0.05认为有统计学意义。结果:1.HIV感染者抗病毒治疗后免疫恢复效果不同对入组的HIV感染者样本进行统计分析,发现IR和INR组在治疗12个月后CD4+T细胞恢复情况出现明显差异,分别为12个月(P=0.001);18个月(P=0.003);24个月(P=0.0003)。将健康对照的CD4+T细胞和HIV感染者治疗前及检测最后一点CD4+T细胞数进行分析,发现IR组在治疗后CD4+T细胞数呈明显的增加(P0.0001),并且CD4+T细胞数与健康对照无差异。而INR组治疗前后则未见明显差异,治疗后CD4+T细胞数仍明显低于健康对照(P0.0001)。IR组治疗后CD4+T细胞数明显高于INR组(P=0.0003)。2.HIV感染者单核细胞亚群分布及Glut1的表达情况对HIV感染者和健康对照进行单核细胞亚群分析发现,IR组和INR组的[I]群单核细胞比例高于健康对照(P=0.019;P=0.038)。健康对照组的[NC]群和[I]群的比例无差异,但在IR组和INR组的[I]群比例均明显高于NC群(P=0.008;P=0.020),IR和INR两组之间各亚群均无差异。对单核细胞各亚群以及Glut1的表达情况进行检测,发现Glut1在[NC]群和[I]群单核细胞表面表达明显升高,在INR组的[NC]群和[I]群单核细胞均高于IR组(P=0.016;P=0.008)和健康对照组(P=0.04;P=0.04)。结果表明,单核细胞的各亚群比例与免疫恢复状态无关,但Glut1的表面表达在INR组明显升高,可能为影响免疫恢复的关键分子。3.Glut1对单核细胞分泌的细胞因子的影响为探索Glut1对单核细胞免疫应答的影响,用siRNA敲减Glut1,检测低表达Glut1对活化后单核细胞分泌细胞因子的影响。发现仅有IL-6和IP-10在siRNA-Glut1组明显分泌减少(P=0.004,P=0.042),证明Glut1表达降低会减少IL-6和IP-10的分泌水平,可能会影响免疫应答。4.血浆中单核巨噬细胞相关的炎性因子与免疫重建的关系收集19例HIV感染者血浆样本,其中7例HC和抗病毒治疗后HIV感染者血浆样本12例,包括6例IR,6例INR。结果表明IP-10在INR组明显高于IR组和HC组(P=0.048;P=0.001),IP-10为HIV感染抗病毒治疗后影响免疫应答效果的关键因子,分泌增加可能会导致单核细胞的免疫应答失败。5.IP-10在HIV感染者血浆中明显升高与疾病进展有关通过检测IP-10在HIV感染者和HCs血浆中的分泌水平,发现HIV感染者血浆IP-10浓度明显高于HCs(P0.0001),IP-10与CD4+T细胞数呈负相关(r=-0.595,P=0.0003),与病毒载量呈正相关(r=0.706,P0.0001)。根据CD4+T细胞数量和病毒载量将HIV感染者分为两组:低CD4+T细胞数组(350 cells/μL;P=0.029)和高病毒载量组(LogVL4;P=0.002)血浆中IP-10均显著升高。说明IP-10与HIV疾病进展密切相关,IP-10为预测疾病的进展的关键生物标志物。6.筛选可调控IP-10的miRNA通过三个miRNA靶标预测工具:TargetScan,miRanda和DIANA进行预测。根据软件评分及匹配程度,在预测结果中挑选出六个的miRNAs与IP-10 3'UTR有6-7个保守种子序列匹配,包括:mi R-15a,miR-16,miR-21,mi R-135a,miR-200和miR-503。miR-21与IP-10 3'UTR有两个结合位点,其他的miRNAs有一个结合位点。在THP-1细胞中过表达6种miRNA的mimics,LPS刺激后检测细胞上清中IP-10浓度确定可调节IP-10水平的miRNAs。结果表明:过表达miR-21(P=0.003)和miR-200c(P0.0001)能够有效抑制IP-10的分泌,但miR-200c的过表达倍数过高,无法在体内实现(未列出数据),最终选择miR-21进行进一步研究。7.miR-21可调节THP-1细胞分泌IP-10在THP-1细胞转染mimics过表达miR-21,发现调节miR-21表达对IP-10的mRNA水平没有影响,但明显抑制LPS刺激后的THP-1细胞分泌IP-10(P=0.041)。表明miR-21可在转录后水平调节IP-10分泌。以同样的方法转染mi R-21的inhibitors,结果显示:miR-21inhibitor并没有显著增加IP-10 mRNA的表达,却有效的促进IP-10的分泌(P=0.015)。说明miR-21对IP-10的调节作用是在转录后水平实现的。8.miR-21直接靶向调节IP-10为探索miR-21与IP-10 3'UTR是否为直接靶向调控关系,进行荧光素酶报告实验。首先将带有WT序列的报告基因载体与miR-21 mimics或inhibitors共同转染至293T细胞,发现miR-21可直接与IP-10 3'UTR靶向结合,抑制IP-10的转录后调节路径。另外通过共转染miR-21和连接mut-1/mut-2报告载体与WT载体进行比较,发现mi R-21对IP-10的调控作用主要是通过结合IP-10 3'UTR上结合位点1(196-202)来实现的。9.miR-21在HIV感染者的单核细胞下调为探索原代单核细胞中miR-21对IP-10的调控作用。分别提取HIV感染者(n=6)和HCs(n=5)的PBMC并分选出单核细胞检测miR-21的表达情况。发现感染者单核细胞中miR-21的表达低于HCs(P=0.044),而血浆IP-10水平明显升高(P=0.029),miR-21表达与IP-10浓度呈负相关趋势(r=-0.502,P=0.057)。我们在HIV感染者的单核细胞中过表达miR-21(P=0.002)LPS刺激后可抑制IP-10的分泌(P=0.057)。以上结果表明,mi R-21可调控单核细胞合成分泌IP-10。10.miR-21和IP-10在THP1-MA细胞表达升高首先检测THP-1到THP-1-MA细胞分化过程中miR-21和IP-10表达水平的变化。发现miR-21和IP-10在THP-1-MA细胞中表达均明显增加(P=0.002,P=0.037)。随后检测THP-1和THP-1-MA细胞在LPS刺激前后IP-10的分泌水平。结果显示THP-1-MA细胞分泌的IP-10明显高于的THP-1细胞(P=0.0008)。11.THP-1-MA细胞中mi R-21对IP-10无调节作用我们已经证实miR-21对IP-10的调控作用,但THP-1-MA细胞中过表达和抑制miR-21但未能有效抑制和促进IP-10的分泌。需要进一步确定miR-21在巨噬细胞中对IP-10的调控机制。12.在THP-1-MA细胞中ISG15表达升高削弱了miR-21对IP-10调节作用ISG15可通过NF-κB路径引起IP-10的分泌,而NF-κB是IP-10产生的关键转录因子。通过siRNA抑制ISG15表达,可明显降低IP-10的mRNA表达(P=0.039)和分泌(P=0.021),同时过表达miR-21可恢复对IP-10分泌的影响,抑制程度高于仅敲减ISG15(P=0.0009)。在THP-1-MA中ISG15表达增加可促进IP-10的表达分泌,而这种促进作用抵消了mi R-21对IP-10的负性调控作用,揭示了在单核和巨噬细胞中miR-21对IP-10的差异性调节机制。结论:1通过检测HIV抗病毒治疗后,免疫恢复效果不同感染者的单核细胞各亚群分布,对Glut1在各亚群细胞的表达情况进行分析,发现INR组CD16+单核细胞表面Glut1表达明显增加,在敲减Glut1后,单核细胞分泌IP-10明显减少。2在预测到的6个候选miRNAs中筛选出能够靶向调控IP-10的miRNA。发现在单核细胞中miR-21能够直接靶向调控IP-10的分泌。在原代单核细胞中,miR-21低表达与IP-10的分泌水平呈负相关趋势。3通过检测巨噬细胞中miR-21对IP-10分泌的影响,发现miR-21在巨噬细胞中对IP-10无明显调控作用,而抑制ISG15的表达可恢复miR-21对IP-10的负性调节作用。ISG15在巨噬细胞中对IP-10的抑制程度明显高于单核细胞,这种调控差异的原因之一是ISG15在巨噬细胞中表达升高。
【图文】：

感染者,细胞数,情况

在第一部分的实验中，收集 HIV 感染者共 19 例，健康对照 9 例，实验对象的详细信息见表 1。入组条件为：①治疗时间：18-24 个月；②治疗前 CD4+T 细胞数：200-500cells/μL；③ IR：治疗后两点的 CD4+T 细胞数均高于治疗前(>30%)；INR：治疗后两点的 CD4+T 细胞数均低于治疗前(<20%)，呈不断降低的趋势，或经治疗后 CD4+T 细胞无明显的增加。HC:未感染 HIV 病毒的健康人。对所选 HIV 感染者样本进行统计分析，在治疗前基线 CD4+T 细胞无差异的前提下，分别统计治疗 6 个月，12 个月，18 个月，24 个月后 CD4+T 细胞数的变化情况，发现 IR 和 INR 组在治疗 12 个月后出现明显差异，分别为 12 个月 P = 0.001；18 个月 P = 0.003；24 个月 P=0.0003 见图 1A。之后将健康对照，HIV 感染者治疗前及检测最后一点 CD4+T细胞进行分析，如图1B，发现IR组在治疗后CD4+T细胞数呈明显的增加(P<0.0001)，并且治疗后的 CD4+T 细胞数与健康对照无差异。而 INR 组治疗前后则未见明显差异，同时治疗后 CD4+T 细胞数仍明显低于健康对照 P<0.0001。IR 组 CD4+T 细胞数明显高于 INR 组 P = 0.0003。

单核细胞,转染,炎性因子,抗病毒治疗

图 3. Glut1 对单核细胞分泌的细胞因子的影响A. 转染 si-Glut1 后，检测 THP-1 表面 Glut1 表达的画门策略；B. 敲减 Glut1 后，THP-1 表面 Glut1 表达效率；C. 转染 si-Glut1 后 mRNA 水平的敲减效率；D-J. 敲减 Glut1 后，对 IL-1β，IL-6，IL-8，IL-17，IP-10，IFN-r，，TNF-r 分泌的影响。3.4 血浆中单核巨噬细胞相关的炎性因子与免疫重建的关系单核细胞是细胞因子分泌的重要来源之一，相较于[C]群单核细胞，[NC]群和[I]群单核细胞可分泌更多的促炎性细胞因子，而这两群细胞在 INR 组比例明显升高，检测患者血浆中的细胞因子是否也分泌增加，收集 19 例受试者血浆样本，其中抗病毒治疗后 HIV 感染者 12 例血浆样本，包括 IR(n = 6)，INR(n = 6)，健康对照(n =
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R512.91;R446.6

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