金葡菌促凝集基因筛查及功能基因初步研究

发布时间：2020-04-23 04:48

【摘要】：研究目的:构建Tn917转座子突变文库,通过血浆凝集实验及动态比浊法筛选及鉴定促凝相关基因,并通过对筛选基因进行验证。构建金黄色葡萄球菌泛醌细胞色素氧化酶A亚基基因缺失突变株,对其生物学功能进行初步探讨;方法:1.利用带有转座子Tn917的温度敏感性质粒转化至RN4220进行修饰后,再转入Newman标准菌株中,通过红霉素和高温诱导转座子随机插入金黄色葡萄球菌中,引起随机突变建立金葡菌转座子突变文库,通过试管凝集实验及动态浊度法对细菌促进血浆凝集能力进行筛选;使用抗性标记挽救法筛选出相应影响的突变基因并应用生物信息学技术预测基因的功能。2.采用基因敲除技术对所筛选到的基因进行验证:通过融合PCR连接目的基因上下同源片段,使用基于位点特异性重组的Gateway克隆技术导入温度敏感性质粒PKOR1,转化大肠埃希菌修饰缺陷型DC10B获得同源重组质粒,并将该质粒导入Newman菌株中,在氯霉素和高温下多次传代,再通过脱水四环素反向筛选,采用基因组PCR和测序技术鉴定突变株。通过试管凝集实验及动态浊度法对细菌促进血浆凝集能力进行鉴定;3.通过细菌生长曲线测定、抗氧化实验、生物被膜形成实验及动物实验等对泛醌细胞色素氧化酶基因功能进行初步探索;结果:1.成功构建了库容量约为2×10~5转座子突变文库,通过观察促进血浆凝集能力共计筛选到499株凝集减弱或消失的突变菌株。对其中85株进行转座子插入位点进行鉴定,确认其中的76个突变菌株的转座子插入位点,涉及基因13个,包括已经报道的与促凝集相关基因4个。2.对其中促凝集能力明显降低且未报道的基因进行敲除验证,证实泛醌细胞色素氧化酶A亚基(cydA)突变后,细菌不能促使血浆凝集。3.cydA基因缺失株在有氧条件下生长并未受明显影响,细菌溶血能力明显减弱,抗氧化能力明显下降,但对生物被膜的形成没有明显影响。在皮肤脓肿模型中,突变株所形成溃疡面积明显减少。菌血症模型中,突变株小鼠生存时间明显延长,预后良好。实时荧光定量PCR检测相关毒力因子表达明显降低。结论:本实验构建的转座子突变文库可用于细菌特定表型相关基因的筛查,除已知影响金葡菌促进血浆凝集能力外筛查并证实了泛醌细胞色素氧化酶A亚基突变后会显著影响血浆凝集。cydA基因在金葡菌致病过程中具有不可或缺的作用,有望作为新的疫苗的靶点。
【图文】：

示意图,转座子,插入位点,筛查

转座子插入位点示意图

反应图,试管

图 1 凝集能力降低或无凝集能力试管反应图Figure 1 A map of reduced or non agglutinating ability注：A：完全凝聚；B：凝聚减弱；C：不凝聚.mplete agglutination; B: Decreased agglutination; C: No
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R440

【参考文献】