基于E基因的非洲型寨卡病毒QPCR检测方法的建立及生物信息学分析

发布时间：2020-04-28 11:12

【摘要】：寨卡病毒(ZIKV)属黄病毒属,是一种通过节肢动物传播的病毒(虫媒病毒)。目前,ZIKV可以分为两个主要谱系,包括非洲谱系、亚洲谱系。1947年,ZIKV首次在非洲的恒河猴中被发现,接下来的数十年间,ZIKV 一直属于“睡眠状态”,只引起散在传播,而且症状较轻,具有自限性。直至2015年,ZIKV在亚洲、非洲以外的巴西首次大面积爆发流行,并迅速向全球其他地区传播。此次爆发的特点包括患者人数激增、传播范围扩大、出现严重并发症(如GBS、新生儿小头畸形等),ZIKV感染严重威胁到人类健康。在2016年ZIKV疫情爆发成为了国际关注的突发公共卫生事件。根据流行毒株的系统发育分析得知,引起近年爆发流行的毒株均属亚洲谱系。本研究建立了基于E基因的非洲型寨卡病毒实时荧光定量PCR检测方法。通过针对ZIKV非洲型标准株MR766(AY632535.2)的E基因编码区设计出上下游引物及探针,开展了相关的特异性、重复性、敏感性的实验,利用本实验室保存的1-4型登革病毒株、HCV-1b RNA、亚洲型寨卡病毒Z16006株、乙脑病毒疫苗株、基孔肯雅病毒验证了本方法所设计引物的特异性;本研究的灵敏度测试结果表明,2.47×101 copies/μl与2.47×l00copies/μl的检测尚不够稳定,2.47×100 copies/μl检测结果阳性为概率事件,故不能作为绝对定量的依据。因此,本方法可应用于临床疑似标本的检测,能实现非洲型ZIKV的早期快速检测、鉴别诊断及标本中的病毒定量。ZIKV E蛋白通过与宿主细胞表面受体结合介导病毒进入宿主细胞,从而开始ZIKV的感染周期,是启动ZIKV进入宿主细胞的关键因素,而且参与了病毒复制周期的全过程。通过对两个谱系E蛋白氨基酸序列的位点进化方向进行分析,发现氨基酸位点的变化引起了非洲型ZIKV、亚洲型ZIKV E蛋白B细胞表位的改变,同时引起E蛋白结构改变。本研究从寨卡病毒E基因生物信息学分析入手,建立非洲型ZIKV的实时荧光定量PCR检测技术;并针对了ZIKV两个谱系的E蛋白进行了生物信息学分析,发现了非洲型ZIKV与亚洲型ZIKV在E蛋白氨基酸序列上的差异位点,并分析了这些统一差异位点与B细胞差异性表位、E蛋白结构之间的联系。本研究有助于实现非洲型寨卡病毒的实验室早期检测,并为进一步开展ZIKV血清学相关检测技术和疫苗的研究提供参考。
【图文】：

图１－２邋ＺＩＫＶ邋Ｅ蛋白的可溶性胞外域单体结构逡逑Ｆｉｇ邋１－２邋Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｏｆ邋ａ邋ｍｏｎｏｍｅｒ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｓｏｌｕｂｌｅ邋ｅｃｔｏｄｏｍａｉｎ邋ｏｆ邋Ｅ邋ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ邋ｏｆ邋ＺＩＫＶ逡逑（Ｄ丨为红色，Ｄ［Ｉ为黄色，Ｄｉｌｌ为蓝色，Ｆｕｓｉｏｎ循环以绿色突出显示）［［５ｎ逡逑１．２寨卡病毒病的传染源及传播途径逡逑寨卡病毒本来存在于偏远的非洲森林，但由于全球化及气候变化，ＺＩＫＶ扩逡逑散到了新的地区。ＺＩＫＶ的宿主可能主要是灵长类动物（包括人），当ＺＩＫＶ疫逡逑情爆发时，人群对于该病毒普遍易感，人群中ＺＩＫＶ的隐性感染者也是重要的传逡逑染源。ＺＩＫＶ在乌干达实现了宿主从猴子到人类的飞跃，，通过病毒血症旅行者、逡逑２逡逑

逑ｑｉ邋｜邋５７２１６７４８邋６邋１邋ｇｂ邋｜邋ＫＦ２邋？，＿ｖ．．．．．．逡逑图２－３图为本研究所设计的上游引物逡逑Ｆｉｇ邋２－３邋Ｔｈｅ邋ｕｐｓｔｒｅａｍ邋ｐｒｉｍｅｒ邋ｏｆ邋ｔｈｉｓ邋ｓｔｕｄｙ逡逑１０逡逑
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R511;R440

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本文编号：2643393