基于CRISPR-Cas13a的H7N9检测技术研究

发布时间：2020-04-29 02:04

【摘要】：人感染甲型H7N9流感病毒是少数几种能感染人的甲型流感病毒之一。当甲型H7N9流感疫情爆发时,常规的流感病毒检测方法因需要昂贵的大型检测仪器和高标准的检测环境而难以发挥作用,因此,迫切需要找到一种适用于现场检测的H7N9甲型流感病毒检测方法。CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)-Cas13a蛋白质是一种经过密码子优化可由原核生物表达的蛋白质。当Cas13a通过单链引导RNA(crRNA)与靶RNA特异性结合时,其蛋白质构象发生改变并产生RNase活性,从而非特异性地降解RNA。利用Cas13a的特性,本文旨在建立一种潜在的H7N9病毒核酸现场检测方法。主要研究结果如下:1、对两种感受态大肠杆菌和两种培养基进行组合筛选,然后取大肠杆菌表达的可溶蛋白质进行SDS-PAGE(polyacrylamide gel electrophoresis),经考马斯亮蓝染色后使用凝胶成像仪分析各蛋白质条带。单因素实验结果表明,使用LB(Luria-Bertan)培养基培养Rosetta 2(DE3)pLysS大肠杆菌表达LwCas13a蛋白质占总蛋白质比例最高达到8.27%。分别对影响大肠杆菌诱导表达的各种因素进行单因素优化,使用控制变量法改变诱导条件,然后对大肠杆菌表达的蛋白质进行SDS-PAGE电泳,经考马斯亮蓝染色后使用凝胶成像仪分析各蛋白质条带。研究结果表明,在大肠杆菌指数生长期OD_(600)值为1.0时,诱导表达的目的蛋白质占总蛋白质的比例最高,达到5.17%;加入0.1 mM IPTG(Isopropylβ-D-Thiogalactoside)时,诱导表达的目的蛋白质占总蛋白质的比例最高,达到5.97%;诱导温度设置为25℃时,诱导表达的目的蛋白质占总蛋白质的比例最高,达到7.43%;诱导16小时时,诱导表达的目的蛋白质占总蛋白质的比例达到最大为8.13%。使用亲和层析法纯化LwCas13a时,纯化效果较差,有许多杂蛋白质存在;使用酶切去亲和层析法纯化LwCas13a时,纯化效果很好,蛋白质进行SDS-PAGE电泳,经考马斯亮蓝染色后使用凝胶成像仪分析纯度很高。2、设计两组阴性对照验证Cas13a蛋白质复合体的活性和特异性。研究结果表明,实验组测得荧光值显著高于两组阴性对照,证明Cas13a蛋白质复合体有RNase活性且针对靶RNA有良好的特异性。参考RNase A间接测量1 IU Cas13a蛋白质复合体,使用二分法测量各组分最适量。研究结果表明,1 IU Cas13a蛋白质复合体由1.875 pmol Cas13a,2.25 pmol crRNA和64.46 pmol靶RNA组成。在1 IU Cas13a蛋白质复合体的基础上稀释Cas13a蛋白质和crRNA以确定最佳使用量。研究结果表明,在20μL检测体系中,应有9.375 nM Cas13a和12.5 nM crRNA,另外加入1μL RNase抑制剂,100 ng人类总RNA,一定量的待检测RNA和300 nM RNA探针以构成检测体系。3、使用实时荧光定量的方法测定提取自H7N9病毒株样本中表达HA(hemagglutinin)和NA(nueraminidase)的RNA浓度。研究结果表明,表达HA RNA浓度为29.14 fM,表达NA RNA浓度为819.72 fM。分别使用该已知浓度样本和标准品RNA评估检测体系的最低检测限及最低检测时间。研究结果表明,该方法能在5 min内检测出1 nM的NA RNA。为提高检测灵敏度,RT-RPA和T7体外转录被引入以构建新的检测体系。针对HA和NA RNA分别设计了3组9对RPA引物,通过筛选确定SX-H3-F+SX-H1-R引物对和SX-N2-F+SX-N3-R引物对分别为针对HA和NA基因的最佳RPA引物。在下游引物5’端加上T7启动子序列并按照RPA试剂盒说明书构建新的检测体系,使用该已知浓度的H7N9 RNA样本评估检测体系的最低检测限及最低检测时间。研究结果表明,该方法能在30 min内检测出100 aM的NA RNA。使用新的检测体系对提取自各种亚型的甲型流感病毒RNA进行检测。检测结果表明,只有H7N9病毒组荧光值显著升高,证明新检测体系特异性良好。因此,我们诱导表达和纯化出了有活性的Cas13a蛋白质,并基于Cas13a蛋白质构建出了针对H7N9甲型流感病毒的具有良好灵敏度和特异性的检测体系。为实现H7N9甲型流感病毒现场检测提供了理论基础。
【图文】：

质粒图谱,操纵基因,阻遏物,基因

2.2 结果与分析2.1 质粒提取与转化.1.1 质粒图谱质粒中含有编码抗氨苄青霉素的基因，因此可用含氨苄青霉素的培养基筛养大肠杆菌。表达目的蛋白 LwCas13a 及标签蛋白的基因由 T7 启动子及纵子调控。Lac 表达产物与操纵基因结合，抑制目的基因进行 T7 转录。乳糖经 β-半乳糖苷酶催化水解成葡糖糖和乳糖，随后发生的副反应生产别与阻遏物结合从而使阻遏物从操纵基因上脱离下来，因此可通过加入诱导这种抑制作用，不被代谢分解的别乳糖类似物 TPTG 效果更佳。在该质粒编码 T7 RNA 聚合酶的基因，因此待转化的大肠杆菌应含有编码 T7 RNA的基因，T7 RNA 聚合酶特异性的识别并结合 T7 启动子，催化目的基因 mRNA，进而表达出目的蛋白。目的蛋白是一个包含 LwCas13a、SUMp-tag II 和 6×His 的蛋白质集合。

电泳图,质粒电泳,质粒

huLwCas13a 质粒电泳图。M，15000 b取的质粒；2，酶切后的质粒。f Twinstrep-SUMO-huLwCas13a plasmid. M extracted from E. coli; 2, Double-digested pl结果如图 2-2 所示，环状质粒相对于线速度慢，其长度不能通过电泳图像来不一的线状 DNA。通过电泳图可以得中被一种酶切割的质粒呈线性状态，成两条线状 DNA，大小符合 5306 bpstrep-SUMO-huLwCas13a 质粒的标准
【学位授予单位】：长江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q78;R446.5

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