痉挛性截瘫基因变异及基因型表型关系研究

发布时间：2020-05-06 15:04

【摘要】：背景与目的痉挛性截瘫是一组以双下肢进行性肌张力增高、剪刀步态和无力为突出表现的神经系统退行性疾病,病程呈缓慢进展。其中,以遗传性痉挛性截瘫(Hereditary spastic paraparesis,简称HSP或SPG)最为典型。HSP具有明显的遗传异质性,可呈常染色体显性、常染色体隐性、X连锁隐性以及线粒体遗传等多种模式。截至目前,共已报道100余种HSP相关致病基因,其中被正式命名收录的已达79个(SPG1~SPG79)。近年来,二代测序(Next-generation sequencing,NGS)技术的广泛应用,越来越多与HSP疾病相关联的新的致病基因被不断发现。同时,HSP的临床异质性明显,伴随人们对已知致病基因新表型认知的拓展,表型与基因型的重叠以及遗传突变方式的多样导致本病在临床上常易被误诊和漏诊。此外,众多以锥体束征为典型表现的非遗传性痉挛性截瘫病例被相继报道,如肌萎缩侧索硬化(Amyotrophic lateral sclerosis,ALS)、腓骨肌萎缩症(Charcot-Marie-Tooth disease,CMT)、遗传性共济失调(Hereditary ataxia,HA)、肾上腺脊髓神经病(Adrenomyeloneuropathy,AMN)及人类T淋巴细胞病毒Ⅰ型(Human T-lymphotropic virus types 1,HTLV-1)感染相关的热带痉挛性截瘫(HTLV-I-associated myelopathy/tropical spastic paraparesis,HAM/TSP)等,这些更加剧了本病临床诊断的困难性。因此,实现本病的精准临床诊断需要倚靠完善的检测分析体系。本研究对拟诊HSP的患者先进行以脊髓小脑共济失调Ⅲ型(Spinocerebellar ataxia type 3,SCA3)为代表的动态突变筛查,然后借助多重连接探针扩增技术(Multiplex Ligation Dependent Probe Amplification,MLPA)进行HSP相关致病基因的拷贝数分析,最后再应用靶向二代测序寻找真正致病基因,以达到精准诊断。此外,本病目前尚无有效治疗手段,其根本原因在于具体致病机制不明。本研究分别选取常染色体显性HSP和常染色体隐性HSP中最为常见的临床亚型,SPG4和SPG11,对患者来源的皮肤成纤维细胞系,进行突变蛋白稳定性、线粒体分布以及自噬-溶酶体形态与融合等的功能研究,以期阐明部分HSP的具体发病机制。方法1.对拟诊的HSP患者,首先采用PCR结合琼脂糖凝胶电泳对其进行ATXN3基因动态突变的排查;其次,通过NGS联合MLPA的方法筛查其HSP相关致病基因;最后,结合临床资料,进一步分析其基因型与表型之间的关系。2.构建SPG4新发突变位点质粒,脂质体转染293T细胞,结合放线菌酮(cycloheximide,CHX)干预,通过蛋白免疫印迹检测突变蛋白的表达水平及其稳定性。3.皮肤活检建立SPG4和SPG11患者的成纤维细胞系,应用细胞免疫荧光和蛋白免疫印迹技术,分析线粒体分布以及自噬-溶酶体形态与融合等的功能变化。4.结合Sanger测序和家系共分离分析,验证ABCD1基因突变,并对确诊的AMN患者临床资料进行分析总结。5.对于基因阴性的患者,依据起病年龄及病程,筛选疑似HAM/TSP患者,通过ELISA和荧光定量PCR分别筛查其血清HTLV-1/2抗体和外周血HTLV-1前病毒DNA明确诊断。结果1.在150个拟诊HSP的家系中,共发现14例先证者的ATXN3基因10号外显子CAG重复数大于44,确诊为SCA3;2.通过MLPA联合靶向二代测序在57例先证者中明确了HSP相关致病基因,其中常染色体显性HSP 25例,包括4例SPG3A(ATL1)、18例SPG4(SPAST)、1例SPG8(KIAA0196)、2例SPG33(ZFYVE27);其中,常染色体隐性HSP 32例,包括20例SPG5(CYP7B1)、6例SPG11(SPG11),SPG28(DDHD1)、SPG30(KIF1A)、SPG35(FA2H)、SPG43(C19orf12)、SPG46(GBA2)及SPG54(DDHD2)各1例。3.在20例SPG5先证者中,我们发现高达65%(13/20)的患者携带纯合突变c.334CT(p.R112*),并进一步证实与奠基者效应有关;4.SPG4 4个新发突变位点不仅会造成spastin蛋白表达量减少,而且还会减弱spastin蛋白的稳定性;5.SPG4患者成纤维细胞内的线粒体存在分布不均,主要聚集于近细胞核处,并且线粒体形态以片段化为主,有别于正常健康对照的长管状形态;6.SPG11患者成纤维细胞内的溶酶体体积异常增大,并且自噬小体异常聚集,但未影响溶酶体和自噬体间的融合;7.共确诊5例携带ABCD1基因突变的AMN患者,其均存在血清极长链脂肪酸比值(C26:0/C22:0)的异常增高,且脑型患者高于单纯型患者;8.依据起病年龄大、病程短,共在79例基因阴性的患者中筛选出3例疑似HAM/TSP患者。根据血清HTLV-1/2抗体阳性和外周血HTLV-1前病毒DNA阳性,最终确诊1例HAM/TSP患者。结论1.临床上很大一部分脊髓小脑共济失调Ⅲ型(SCA3)患者会出现典型锥体束体征而易被误诊为HSP,应予以鉴别,通过PCR等方法对ATXN3基因动态突变的排查可降低误诊率;另外,MLPA可特异性检测目的基因拷贝数变异,这些均是目前二代测序所不能取代的。2.靶向二代测序可高效准确的定位致病突变基因。本研究共确诊57例HSP先证者,涵盖12种临床亚型;同时,还发现25个新致病突变位点以及一些罕见亚型的临床表型,在一定程度上丰富了中国HSP基因突变数据库及临床表型谱。3.SPG4和SPG5,分别是福建地区常染色体显性HSP和常染色体隐性HSP最为常见的临床亚型。其中,SPG5 CYP7B1基因存在热点突变c.334 CT(p.R112*)。4.线粒体和自噬-溶酶体的功能障碍在HSP的致病过程中起着重要作用。5.以AMN为代表的过氧化物酶体病主要表现为上运动神经元受损症状,且大部分无影像学征象,极易误诊为HSP,通过基因检测结合VLFAC等生化检测可予以鉴别;另外,部分地区流行的HTLV-1病毒感染所引起的热带痉挛性截瘫也易与HSP混淆,通过检测病毒抗体及DNA序列可明确诊断。
【图文】：

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HSP 或 SPG）最为典型。国外报道，HSP 人群发病率大约在 2-10/10 万。根据其临床表现，可以将 HSP 分为两型：单纯型：单纯双下肢痉挛、无力，伴或不伴膀胱括约肌功能障碍；复杂型：除单纯型体征外，常常伴随其它体征，包括认知障碍、癫痫、胼胝体及小脑退化、皮损、视神经萎缩、肌萎缩症或周围神经受损体征等[3]。HSP 的遗传异质性表现在，截至目前已报道的致病基因超过 70 个，按其基因发现先后顺序，可分为 SPG1~SPG79，且不包括其它非典型 HSP 致病基因[4,5]。与 HSP 有关的致病基因的功能主要涉及到以下几个方面：膜运输、轴突运输和微管形成异常、脂质代谢和线粒体功能紊乱、内质网形态异常等(图 1.)[4,6]。作为单基因病，HSP 遵循经典的孟德尔遗传，包括常染色体显性（AD）、常染色体隐性（AR）、X-连锁或线粒体母系遗传。其中，常染色显性遗传性痉挛性截瘫(ADHSP)最为常见，约占 70%，而 SPG4 是 ADHSP 中发病率最高的亚型，约占ADHSP 的 40%[7]；常隐性遗传性痉挛性截瘫(ARHSP)中最为常见的亚型为 SPG11，约占 ARHSP 的 50%[8]。

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【学位授予单位】：福建医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R741;R440

【参考文献】