基于达托霉素亲和作用的革兰氏阳性菌检测新方法

发布时间：2020-05-10 18:07

【摘要】：感染性疾病是导致公众死亡的重要原因之一,其对公共卫生和公共安全造成了巨大的威胁,这一情况在发展中国家尤为严重。全球每年死于感染性疾病的人数占了死亡总人数的四分之一。革兰氏阳性菌是临床患者感染的主要致病菌,其中又以葡萄球菌感染最为常见,它会引起多种致命的疾病,诸如肺炎、心内膜炎、骨髓炎、菌血症等。因此,建立快速、简单、灵敏的革兰氏阳性菌检测新方法对于应对传染病爆发、群体性食物中毒以及其它突发公共卫生事件具有重要的意义。本研究基于达托霉素与革兰氏阳性菌细胞膜的亲和作用,结合生物发光法和荧光分析法,构建了三种用于革兰氏阳性菌检测的新方法。(1)基于达托霉素亲和作用的生物发光分析法检测革兰氏阳性活菌本工作基于达托霉素的特异性亲和作用,建立了一种新型的生物发光分析法,用于革兰氏阳性活菌的快速检测。达托霉素是一种针对革兰氏阳性菌的脂肽类抗生素,在Ca~(2+)的作用下,达托霉素与细菌细胞膜之间具有较强的结合能力。本工作将其偶联在磁珠上作为识别试剂,可实现对革兰氏阳性菌的高效分离和富集。利用十六烷基三甲基溴化铵将捕获的细菌裂解后,通过荧光素-荧光素酶生物发光体系检测释放出的细胞内三磷酸腺苷的含量,进而实现革兰氏阳性活菌总量检测。本方法选用了四种革兰氏阳性菌为模式待检物,分别是金黄色葡萄球菌、变异链球菌、枯草芽孢杆菌和表皮葡萄球菌。研究结果表明,四种细菌的线性范围均为1.0×10~2-3.0×10~6 CFU mL~(-1),检测限为33 CFU mL~(-1)。整个检测过程可在20分钟内完成。革兰氏阴性菌和革兰氏阳性死菌对本方法几乎没有干扰,表明本方法具有良好的特异性。本方法可用于奶酪、牛奶、湖水、人尿液和生理盐水中革兰氏阳性活菌的检测,回收率为75.0%-120.0%。同时,本方法具有灵敏度高,检测时间短,操作简便等优点,在食品卫生、环境监测、临床诊断和药品安全等方面有较好的应用前景。(2)基于达托霉素功能化磁珠联合溶葡萄球菌酶构建生物发光分析法检测葡萄球菌本工作基于达托霉素和葡萄球菌细胞膜之间的结合作用,以及溶葡萄球菌酶对葡萄球菌的特异性裂解作用,构建了一种用于检测葡萄球菌的生物发光分析法。本研究选用达托霉素功能化的磁珠作为识别试剂,可从样品基质中高效地分离和富集葡萄球菌。其后,采用溶葡萄球菌酶作为裂解试剂,基于其对葡萄球菌细胞壁上肽聚糖内的五甘氨酸肽键桥的水解作用,特异性地裂解葡萄球菌,并释放出细胞内的三磷酸腺苷。基于荧光素-荧光素酶生物发光体系,进而实现对葡萄球菌的定量检测。本研究以金黄色葡萄球菌为例,研究了该方法用于检测葡萄球菌的可行性。研究结果表明,金黄色葡萄球菌的线性范围是5.0×10~2-5.0×10~6 CFU mL~(-1),检测限为3.8×10~2 CFU mL~(-1)。整个检测过程可在20分钟内完成。革兰氏阴性菌和其它革兰氏阳性菌对金黄色葡萄球菌的检测几乎没有干扰,表明本方法较好的专一性。该方法可用于牛奶和生理盐水注射液中金黄色葡萄球菌的检测,回收率在88.0%-96.0%之间,表明本方法具有较好的应用前景。(3)基于双位点识别的荧光分析法检测金黄色葡萄球菌本工作基于达托霉素和IgG对金黄色葡萄球菌的双结合位点,构建了一种基于双位点识别模式的荧光分析法,可实现对金黄色葡萄球菌的快速检测。IgG的Fc段可与金黄色葡萄球菌表面的A蛋白特异性结合,故可作为第一种分子识别试剂捕获金黄色葡萄球菌。在Ca~(2+)的作用下,达托霉素可将其亲脂性尾部插入金黄色葡萄球菌细胞膜从而与细菌紧密结合。可利用这一机制,将荧光素标记的达托霉素作为第二种分子识别试剂。两种分子识别试剂的联用,可提高金黄色葡萄球菌检测的特异性。革兰氏阴性菌和其它革兰氏阳性菌对金黄色葡萄球菌的检测几乎没有干扰。金黄色葡萄球菌的线性范围是5.0×10~3-5.0×10~8 CFU mL~(-1),检测限为3.6×10~3 CFU mL~(-1)。该方法操作简单,不需要破碎细胞,整个检测过程在90分钟内即可全部完成,且成功应用于湖水和生理盐水中金黄色葡萄球菌的检测,回收率在87.0%-120.0%之间。
【图文】：

死亡原因,感染性疾病,细菌

图 1-1 全世界主要死亡原因Fig. 1-1 Leading causes of death worldwide.细菌在自然环境中无处不在，可通过多种途径进行传播，例如饮水、食物、空气和生物接触。细菌一旦入侵人体免疫系统，就会引起各种症状，甚至是引发一些严重的感染性疾病，，如肺炎、脑膜炎、骨髓炎和败血症等[4]。由细菌引发的感染性疾病对人类健康、社会稳定和经济发展造成了巨大的危害。历史上的三次全球鼠疫大爆发夺去了上亿人的生命[5]。2001 年美国恐怖分子将炭疽芽孢杆菌作为生物武[6,7]

伤寒沙门氏菌,免疫传感器,表面等离子体共振,抗体

第 1 章文献综述ingfragment），另一个是不能结合抗原但能与细胞表面的抗体受体结合的rystallizablefragment）。大多数抗原结构非常复杂且含有多个不同的表位，刺激机体的免疫系统会同时激活多种 B 细胞，产生具有不同表位特异性体。这些抗体被称为多克隆抗体。相反，单克隆抗体是由单个 B 细胞产对某一特定抗原表位的抗体。由于现代快速生物传感系统的需要，抗体已品和临床样本中致病菌检测的重要亲和配体。抗体具有很高的灵敏度和固定的抗体可以与微生物表面的抗原相互作用，从而达到识别致病菌的目
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：O657.3;R446.5

【相似文献】