高分子量激肽原在宿主应答革兰氏阴性细菌感染中的双重作用

发布时间：2020-05-11 08:29

【摘要】：[研究背景和意义]革兰氏阴性(Gram negative,G~-)细菌感染是导致脓毒症的主要致病菌。G~-细菌释放的内毒素又称脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)是导致脓毒症的重要因素。G~-细菌入侵机体后,宿主免疫系统在感染局部感知识别细菌并将其有效清除;但当感染不可控时,机体免疫应答由起初的局部防御作用演变为失控的系统性过度应答,不能恢复到体内的平衡状态,最终形成以持续的过度炎症反应为特征的病理综合征。目前,虽然抗感染治疗和器官功能支持等疗法在一定程度上改善了脓毒症症状,但是脓毒症发病率和死亡率仍居高不下。究其原因,主要是对机体在感染中反应失调的机制,尤其是机体天然免疫系统如何由早期对细菌感染的局部应答和防御,演变为后期的系统性炎症反应的过程仍不清楚。因此深入认识宿主早期对细菌感染的防御识别,及大量细菌物质如LPS释放引发的失控性炎症反应的作用及机制,对阐明细菌感染演变为脓毒症的病理过程,并寻求新的靶向干预措施具有非常重要的临床意义。血浆高分子量激肽原HK(High molecular weight kininogen,HK)是血浆激肽释放酶-激肽系统(Plasma kallikrein-kinin system,KKS)的主要成员。进化分析显示KKS系统与天然免疫系统同源进化,尤其是HK在调控免疫反应中发挥重要作用。且HK可与多种G~-细菌结合,与G~-细菌感染及脓毒症发病密切相关。但是HK在宿主应答G~-细菌感染及其所致脓毒症中的确切作用及相应机制目前仍不清楚。[研究目的]明确HK在感染早期宿主应答识别G~-细菌和后期内毒素血症形成及其所致系统性炎症反应中的作用及机制。[研究方法]1.Kng1基因敲除小鼠的制备与鉴定懫用Cre/loxp系统敲除Kng1基因的2-3号外显子,制备全身性Kng1基因敲除小鼠,并分别从基因组DNA水平,肝脏mRNA水平以及血浆蛋白水平进行鉴定。2.在体观察HK在细菌感染所致脓毒症中的作用采用小鼠盲肠结扎穿孔(Cecal ligation and puncture,CLP)和E.coli腹腔感染两种细菌感染模型,观察Kng1~(+/+)与Kng1~(-/-)两组小鼠生存率;E.coli细菌感染后HE染色组织病理学分析肺组织损伤情况;血平板涂板计数菌落克隆形成数(colony-forming units,CFU)分析小鼠血浆、肝脏和脾脏的载菌量,评价小鼠体内的细菌负载情况;Luminex检测小鼠血浆中主要促炎因子水平。3.体外检测HK对E.coli细菌增殖的影响E.coli细菌分别与野生型大、小鼠和HK缺乏大、小鼠的血浆共培养,运用酶标仪实时记录OD值变化情况,绘制细菌增殖曲线;LB固培涂板计数细菌CFU,综合评价HK对细菌增殖的影响。4.HK与E.coli细菌结合情况(1)体内检测HK与细菌的结合情况。Kng1~(-/-)小鼠耳部皮下接种E.coli后,分别给予静脉注射碘化标记的HK蛋白~(125)I-HK和对照蛋白~(125)I-BSA,2小时后小动物同位素活体成像检测HK是否与E.coli结合。(2)体外流式分析FITC标记的HK蛋白FITC-HK与E.coli细菌的结合能力。5.HK与G~-细菌结合的机制分析(1)流式细胞术分析FITC-HK与G~-细菌结合是否依赖于标志物分子LPS。(2)HK与LPS结合水平的概况分析。亲和共沉淀检测LPS与人、小鼠血浆中HK是否直接结合;ELISA亲和实验分析HK纯蛋白与LPS的结合情况;表面等离子体共振法定量测定HK与不同G~-细菌种属来源的LPS结合水平,并分析HK与LPS组成部份脂质A(Lipid A)的结合能力,以解离平衡常数KD值(KD=结合速率常数K_a/解离速率常数K_d)表示;蛋白液相色谱(Fast protein liquid chromatograpHy,FPLC)分析液相条件下LPS与HK形成复合物的特性并计算LPS与HK结合的分子摩尔比。(3)解析HK轻链第五结构域中与LPS结合的功能序列合成8条30个氨基酸长度的重叠肽,每条多肽序列依次以15个氨基酸重复递进,覆盖第五结构氨基酸序列全长(402V-520G)。采用亲和共沉淀法检测各多肽序列是否竞争性抑制HK与LPS的结合。(4)HK与细菌结合是否被活化裂解建立E.coli细菌腹腔感染模型,ELISA检测血浆中BK含量;制备特异性识别HK的LPS结合位点(即DHGHKHKHGHGHGKH,DHG15)的单克隆抗体6C9G4,通过蛋白免疫印迹法(Western blotting)检测G~-细菌感染脓毒症患者和E.coli细菌感染小鼠血浆中是否含有DHG15序列抗原表位的HK活化裂解片段。6.HK在宿主抵抗G~-细菌感染所致脓毒症中的作用机制(1)ExPASy网站软件(Compute pI/Mw)分析DHG15序列的等电点,电荷等理化特性。(2)流式细胞术检测FITC标记的DHG15多肽序列(FITC-DHG15)与E.coli细菌的结合情况。(3)梯度浓度的DHG15多肽与E.coli细菌共孵育后,流式细胞术分析碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)阳性细菌百分比(PI阳性定义为细菌胞膜发生溶解的细菌),LB固培涂板计数细菌CFU,综合评价DHG15多肽的杀菌效应。(4)DHG15多肽序列的毒理分析CCK-8法检测DHG15多肽对哺乳动物细胞RAW264.7的细胞毒性;红细胞溶血实验检测DHG15多肽对小鼠红细胞的溶血活性。(5)DHG15肽在体内的抗菌效应。建立E.coli细菌腹腔感染模型,静脉给予DHG15多肽,16小时后取材血平板涂板计数细菌CFU(包括血液及肝脏、脾脏、肾脏组织研磨液),分析小鼠体内载菌量情况。7.判定HK在LPS诱导的内毒素血症中的作用采用腹腔注射LPS建立小鼠内毒素诱导的脓毒症模型,观察Kng1~(+/+)与Kng1~(-/-)两组小鼠生存率;Luminex检测血浆中促炎因子TNF-α,IL-1β,IL-6和HMGB-1的水平;制作肺组织病理切片,HE染色检测肺组织病理变化。8.HK对LPS代谢清除的影响(1)应用显色基质鲎试剂(Limulus Amebocyte Lysate,LAL)测定小鼠、大鼠内毒素血症模型中血浆循环LPS含量。进一步运用高效液相色谱-质谱-质谱联用法(HPLC/MC/MC)分析LPS萃取物3-羟基十四烷酸(3-hydroxytetradecanoic acid,3-HM)含量,测定大鼠内毒素血症模型中血浆LPS浓度。(2)将碘化标记的LPS(~(125)I-LPS)静脉注射30分钟后收集外周血血浆和肝脏,检测血浆和肝脏组织中的的放射性含量。(3)DHG15序列在HK维持LPS血浆浓度的作用应用哺乳动物细胞表达体系制备缺失DHG15序列的HK蛋白:HK/Δ492-506,将HK/Δ492-506蛋白静脉注射入Kng1~(-/-)小鼠后再给小鼠腹腔注射LPS,LAL法检测蛋白注射前后小鼠血浆中LPS含量。9.HK裂解产物HKa(双链HK)及其功能域LC对LPS活性的影响(1)应用酶标仪检测BODIPY FL-LPS荧光动态变化,分析HK及其活化产物HKa,HC以及LC对LPS的解聚情况。LPS解聚程度与BODIPY的荧光强度呈正比。(2)ELISA法检测HKa和LC对LPS诱导RAW264.7单核细胞产生炎症因子的生物学活性影响。10.运用6C9G4单克隆抗体抑制LPS与HK的结合在治疗LPS诱导的内毒素血症中的作用观察6C9G4抗体治疗后是否缓解LPS所致小鼠死亡率,系统炎症性反应以及肺组织病理损伤程度;分析支气管肺泡灌洗液(Bronchoalveolar lavage fluid,BALF)中总蛋白量,白细胞总数和髓过氧化物酶(Myeloperoxidase,MPO)含量评价肺组织炎症程度。11.人与小鼠HKa调节LPS生物学活性的差异(1)应用酶标仪检测人源HKa(hHKa)和鼠源HKa(mHKa)对LPS的解聚效率和解聚程度。(2)ELISA法分析hHKa和mHKa对LPS诱导RAW264.7单核细胞产生炎症因子的活性影响。(3)Western blotting法检测人与小鼠血浆中单链HK的含量。[研究结果]1.Kng1基因敲除小鼠制备成功鼠尾基因组PCR鉴定可见Kng1基因2号和3号外显子被成功敲除;RT-PCR结果显示Kng1基因敲除小鼠(Kng1~(-/-))肝脏组织中Kng1 mRNA无表达,但不影响Kng2 mRNA的正常表达;免疫印迹结果进一步显示Kng1~(-/-)小鼠血浆中无HK蛋白表达,表明Kng1基因敲除小鼠构建成功。2.HK在细菌感染所致脓毒症中发挥宿主抵抗的保护作用。在CLP和大肠杆菌E.coli细菌腹腔感染两个脓毒症模型中,HK缺乏的Kng1~(-/-)小鼠生存率较野生型Kng1~(+/+)小鼠显著降低,与此相应地可见HK缺乏显著加重E.coli细菌感染小鼠肺组织损伤,增强系统炎症反应并增加脏器和血液的载菌量。3.体外细菌增殖实验发现血浆HK的缺乏促进E.coli细菌增殖,表明HK具有杀菌或抑制细菌生长的作用。4.HK与E.coli细菌直接结合(1)小动物同位素活体成像显示HK在体内可快速募集至E.coli细菌感染灶处。(2)体外流式结果可见HK与E.coli细菌呈浓度依赖性结合,在约100nM HK时到达饱和。5.HK通过位于轻链第五结构域的DHG15序列与LPS结合识别G~-细菌并被活化(1)当EDTA提前处理E.coli使LPS解体后,HK与E.coli细菌的结合几乎完全消失,表明HK通过LPS与E.coli细菌结合。(2)LPS微球特异性与血浆中HK蛋白结合而将其亲和沉降出来,而对照微球未见相应HK条带;亲和ELISA检测可见HK与LPS呈浓度依赖性结合;HK通过LPS糖链结构与G~-细菌不同种属来源的LPS(K.pneumoniae,P.aeruginosa,S.minnesota)呈高亲和性结合,解离平衡常数为皮摩尔水平。FPLC结果显示HK与LPS结合后形成HK/LPS复合物,平均每个LPS分子结合1-2个HK分子。(3)免疫印迹结果显示只有第6条和第7条多肽可竞争性抑制HK与LPS的结合。分析多肽6和多肽7的序列可得两者的共有序列是DHGHKHKHGHGHGKH,将其命名为DHG15。提示位于HK第五结构域中的DHG15序列是HK与LPS结合的功能性位点。(4)G~-细菌脓毒症患者和E.coli细菌感染小鼠的血浆中可见HK活化裂解暴露出DHG15序列表位的降解片段。6.DHG15多肽是宿主防御性多肽DHG15序列表现出和天然抗菌肽类似的特性,如表面带正电荷。DHG15多肽呈浓度依赖性与E.coli细菌直接结合,对E.coli细菌具有与LL-37相当的杀菌效应,但对哺乳动物细胞无溶血活性并表现出低毒性,是一种安全的抗菌肽。DHG15多肽显著降低小鼠感染E.coli细菌后血液和脏器中的载菌量。7.HK的缺乏对LPS所致死亡具有保护作用Kng1~(+/+)小鼠和Kng1~(-/-)小鼠腹腔注射致死剂量的LPS后,约90%的Kng1~(+/+)小鼠在50小时内死亡,而Kng1~(-/-)小鼠全存活,相应地可见HK缺乏显著缓解了LPS导致的急性肺损伤,抑制了系统性炎症反应。8.(1)HK缺乏降低内毒素血症血液循环中LPS水平HK缺乏的小鼠和大鼠血液循环中LPS水平显著降低,促进LPS向肝脏代谢清除。(2)DHG15序列是HK维持LPS血浆浓度的关键位点Kng1~(-/-)小鼠在补偿HK/Δ492-506重组蛋白后未见血浆LPS水平升高至与野生型小鼠相当的水平,证实HK中与LPS结合的DHG15氨基酸序列是HK维持LPS血浆浓度的关键序列。9.HK通过轻链LC促进LPS生物学活性HKa及其功能域轻链LC,直接解聚LPS形成单体,且具有促进LPS促炎效应的生物学活性。10.特异性识别DHG15序列的单克隆抗体6C9G4缓解LPS诱导的内毒素血症通过抑制LPS与HK的结合,6C9G4抗体有效缓解LPS诱导的小鼠死亡及急性肺损伤,显著降低循环LPS浓度和系统性炎症因子水平,同时可见显著降低了BALF中的白细胞总数,总蛋白量以及肺组织裂解液中MPO水平。11.人与小鼠HKa对LPS具有同等的生物学活性人源HKa(hHKa)和鼠源HKa(mHKa)与LPS的结合力相当,表现为等同的LPS解聚能力及对LPS促炎效应的促进作用,即hHKa与mHKa两者本身具有相等的LPS生物学活性调控作用。但人血浆中与LPS结合的含DHG15序列的全长单链HK的浓度是小鼠血浆中的2倍。[结论]1.HK是新的针对LPS的模式识别分子(Pattern recognition molecules,PRMs)。HK通过识别LPS与G~-细菌结合,感知入侵细菌的存在,并被裂解暴露出DHG15序列发挥杀菌效应,从而作为“监视预警”分子,在宿主早期抵抗G~-细菌感染中起重要的防御保护作用。2.HK是新的关键LPS载体,具有持续性维持血液循环LPS水平的特异性作用,从而加强宿主对LPS的系统性炎症反应,可能是G~-细菌感染后期形成内毒素血症的重要机制。3.HK在宿主应答G~-细菌感染的过程中具有“双刃剑”效应。G~-细菌感染早期,HK识别G~-细菌LPS而感知入侵细菌,并发挥杀菌效应;当G~-细菌破坏释放大量LPS时,HK作为LPS载体维持LPS血浆浓度,促进系统性炎症反应,从有利的宿主防御转向有害的促炎效应。4.HK是治疗内毒素血症的新的有效靶点。
【图文】：

示意图,构建策略,基因敲除小鼠,小鼠

图1. Kng1基因敲除小鼠的构建策略和鉴定lox小鼠的构建策略及打靶载体示意图。Loxp位点分别位于Kng1基因外显子2和）Kng1基因敲除小鼠鉴定。B：提取小鼠鼠尾基因组，使用相应引物对小鼠；C：提取Kng1+/+和Kng1-/-小鼠的肝脏RNA，RT-PCR检测肝脏组织中Kng1水平，，action用作内参；D：收集Kng1+/+和Kng1-/-小鼠血浆，Western blottin

脓毒症,细菌感染,混合感染,小鼠

图 2. HK 缺乏小鼠在多菌性混合感染和 E.coli 细菌感染所致脓毒症中更易死亡建立轻度 CLP 模型（左侧图）和 E.coli 细菌腹腔感染模型，观察小鼠生存情况，绘制生存曲线。结果使用 log-rank test 进行统计学分析. *, P < 0.05；**, P < 0.01。
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R459.7

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