泛素连接酶NEDD4-1基因对脑胶质瘤侵袭和增殖作用的MRI评价
发布时间：2020-05-17 14:10
【摘要】：第一部分NEDD4-1基因在胶质瘤细胞中的表达及作用分析目的检测NEDD4-1基因在人脑胶质瘤细胞株U251中的表达情况,构建NEDD4-1基因靶向RNAi慢病毒载体,并包装病毒载体。通过干扰NEDD4-1基因在细胞株U251中的表达,进一步探讨NEDD4-1基因对U251细胞的转移、侵袭、增殖和凋亡能力的影响作用,为下一步实验奠定基础。方法首先,通过反转录聚合酶链反应(RT-PCR)验证在mRNA水平上NEDD4-1基因在脑胶质瘤细胞株U251中的表达。用NEDD4-1RNAi慢病毒表达载体体外感染U251细胞,下调NEDD4-1基因表达,验证转染效果。然后,以RT-PCR、Western blot检测转染后U251细胞中NEDD4-1 mRNA和蛋白的表达,并进一步用Transwell、MTT、流式细胞技术继续探讨NEDD4-1基因在脑胶质瘤细胞中转移、侵袭、增殖和凋亡过程中的作用。结果1.实验结果表明,NEDD4-1 mRNA在脑胶质细胞系中表达。2.成功构建含有NEDD4-1 RNAi的慢病毒表达载体,将该载体进行包装,成功感染人脑胶质瘤细胞U251细胞株。3.MTT绘制生长曲线显示:与U251-NC组细胞相比,U251-KD组细胞的增殖减慢(P0.05)。4.细胞周期结果表明:U251-KD组细胞相对于U251-NC组细胞,G0-G1期细胞数目均明显增加(P0.05),S期的细胞数目明显减少(P0.05),处于G2/M期细的数目无显著差异(P0.05)。这说明发生了 G1期阻滞。与U251-NC组细胞相比,U251-KD组细胞凋亡率显著升高(P0.05)。5.NEDD4-1基因对胶质瘤细胞转移和侵袭能力影响显著。U251-KD组细胞与U251-NC组相比,转移和侵袭能力均明显较低(P0.01)。结论NEDD4-1基因在人脑胶质瘤细胞系中表达,且NEDD4-1基因可调控人脑胶质瘤细胞进行体外转移,并对侵袭、增殖及凋亡等生物学特性中发挥重要作用。第二部分NEDD4-1基因在人脑胶质瘤组织中的表达及与临床病理特征的相关性研究目的研究E3泛素连接酶NEDD4-1基因在脑胶质瘤组织中的相应蛋白;探讨其mRNA表达与患者年龄、性别、肿瘤最大直径、胶质瘤病理级别、Ki-67、p53指标之间的相关性;分析不同病理级别脑胶质瘤组织中MRS定量参数值与NEDD4-1表达的相关性。方法对52例病理证实为脑胶质瘤住院患者,术前在SIMENS Prisima 3.0 T磁共振扫描仪上,使用64通道头颈联合线圈进行常规MRI平扫、增强序列及MRS相关检查,并在术后提取肿瘤实质区的组织标本。根据E3泛素连接酶NEDD4-1的序列设计相应引物,应用RT-PCR方法检测肿瘤组织中NEDD4-1 mRNA表达况。应用免疫组化法、western blot检测NEDD4-1蛋白在52例脑胶质细胞瘤组织中的表达。分析NEDD4-1表达与患者年龄、性别、肿瘤最大直径、胶质瘤病理级别、增殖抗原Ki-67、p53指标之间的相关性;检测NEDD4-1蛋白表达与不同级别脑胶质瘤MRS磁共振信号参数变化的相关性。结果1.磁共振波谱分析揭示了人脑胶质瘤的瘤实体和瘤周组织之间的Cho/Cr,Cho/NAA差异有统计意义。2.人脑胶质细胞瘤组织中NEDD4-1蛋白阳性细胞染色定位于胞浆和/或胞膜。在52例人脑胶质细胞瘤组织标本中,有40例肿瘤组织标本检测到NEDD4-1表达,表达阳性率为76.9%。在人脑胶质瘤肿瘤组织中,不同级别脑胶质瘤NEDD4-1蛋白阳性表达率的差异有意义(P0.05)。随着肿瘤临床病理级别的增高,NEDD4-1蛋白表达的阳性率也升高,并且在I～IV级肿瘤组织间差异显著(P0.05)。然而,研究发现NEDD4-1的表达与患者的年龄、性别及肿瘤大小无相关性(P均0.05)。3.人脑胶质瘤组织中NEDD4-1与增殖抗原Ki-67和p53均呈正相关性。4.人脑胶质瘤组织中NEDD4-1与各级别脑胶质瘤MRS中的Cho/Cr和Cho/NAA均呈正相关性。结论1.NEDD4-1对胶质瘤的增殖侵袭有一定作用。NEDD4-1 mRNA和蛋白在脑胶质瘤组织中表达,随着脑胶质病理级别的升高而增强。2.NEDD4-1结合1H-MRS作为胶质瘤增殖侵袭性评价的有效指标。人脑胶质瘤组织中NEDD4-1表达与增殖抗原Ki-67和p53均呈正相关性,也与各级别脑胶质瘤MRS中的Cho/Cr和Cho/NAA呈正相关性。第三部分磁共振扩散峰度成像与NEDD4-1表达的相关性研究目的分析在不同级别脑胶质瘤中,NEDD4-1表达与DKI的MK、Ka、Kr、FA、MD参数的相关性。将DKI参数作为NEDD4-1在胶质瘤中表达的无创性、预测性评估手段可行性分析。通过两着结合,研究评价胶质瘤的增殖和侵袭的方法。方法回顾性收集我院2015年6月至2017年12月间,经病理证实为脑胶质瘤的住院患者,共52例。所有纳入患者均进行常规MRI平扫及DKI检查。磁共振常规序列和DKI序列是在具有64通道头颈联合线圈的SIMENS Prisima 3.0 T磁共振扫描仪下进行,扫描时间约30分钟。DKI参数:TR/TE=3500.0 ms/78.0 ms,b=0、500、1000、1500、2000、2500,弥散方向=30,层厚 5.0mm,层数 20,FOV=220mm×220mm,扫描时间9分01秒。图像处理:使用DKE软件(第三方软件)进行DKI数据处理,参考T2WI轴面和增强肿瘤的实性成分,手动画取ROI,并使用同层面肿瘤区对应的对侧脑白质(NAWM)。将肿瘤区的MK、Ka、Kr、FA、MD等参数值与NAWM区相应的脑白质值相比,得出矫正后的各级别脑胶质瘤对应的MK、Ka、Kr、FA和MD等参数值。结合第二部分研究结果,对52例脑胶质细胞瘤组织中的E3泛素连接酶NEDD4-1表达水平进行因素方差分析(One-way ANOVA)和L-S-D检验。将各级别胶质瘤的MK值、Ka值、Kr值、FA值和MD值进行分组,并组间比较。绘制ROC曲线,计算曲线下面积,并预测有效参数的阈值。采用独立样本t检验,Pearson线性相关或Spearman等级相关分析比较组间MK值、Ka值、Kr值、FA值和MD值与性别、年龄、NEDD4-1表达量等变量间的相关性。结果1.DKI参数MK值、Ka值、Kr值在不同级别脑胶质瘤中差异有统计学意义(P0.01)。然而在不同胶质瘤级别之间,MD值和FA值均没有统计学差异(P0.05)。2.年龄与MK值之间呈正相关,年龄与Ka值之间呈正相关,年龄与Kr值之间呈正相关,年龄与FA值之间呈负相关,与MD值之间无相关性。3.各级别组胶质瘤患者中男、女性之间的MK值、Ka值、Kr值、FA值和MD值的差异无统计学意义(P0.05)。4.脑胶质瘤组织中NEDD4-1 mRNA表达与MK呈正相关(r=0.691 P0.01),与Ka呈正相关(r=0.604P=0.000),与Kr呈正相关(r=0.630 P=0.000),与MD值呈负相关(r=-0.350P=0.011),与FA值无相关性(r=-0.061P0.05)。结论DKI有助于胶质瘤分级恶性程度的诊断,可作为NEDD4-1在脑胶质瘤中表达的预测工具。DKI联合NEDD4-1的表达可更好地评价脑胶质瘤的增殖侵袭分级程度。
【图文】：
ＳＹＢＲ邋ｐｒｅｍｉｘ邋ｅｘ邋ｔａｑ逦６．０｜ｉＬ逡逑（２）邋Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ邋ＰＣＲ通过两步法进行，，并绘制熔解曲线。流程图如下图１．１。逡逑逦逦Ｉ逦逦Ｉ逦Ｉ逦｜逡逑Ｐａｔｔｅｒｎ逦Ｈｏｌｄ逦２邋Ｓｔｅｐ邋ＰＣＲ逦Ｄｉｔｓｏａａｔｉｏｎ逡逑Ｓｅｇｍｅｎｔ逦逦１逦１２逦１２逦３逡逑１００－逡逑：／＾一ｌ厂Ｌ厂逡逑逦０－逡逑逦Ｃｙｄｅ逦邋１逦４０逦１逡逑Ｔｅｍｐｅｆａｔｕｆｅ邋（ｄｅｇ）逦９５．０逦９５．０逦６０．０逦９５．０逦６０．０逦９５．０逡逑Ｈｏｌｄ邋Ｔｉｍｅ邋（ｍｍ邋ｓｓ）逦００：３０逦００：０５逦Ｉ邋００：３０逦００：１５逦丨逦００：３０逦邋００：１５逡逑Ｄａｔａ邋Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ邋１邋￣Ｉ￣￣ｉ￣ａ￣Ｉ￣Ｉ￣￣ｉ￣Ｉ逡逑图１．１两步法ＲＴ－ＰＣ邋Ｒ流程图逡逑２．４．４数据分析逡逑ＡＣｔ＝目的基因Ｃｔ值－内参基因Ｃｔ值；逡逑－ＡＡＣｔ＝ＮＣ组ＡＣｔ平均值－各样品ＡＣｔ值；逡逑相对定量分析Ｆ＝２－ＡＡＣｔ；逡逑相对ＮＣ组样品，各样品目的基因的相对表达水平由Ｆ反映。逡逑３邋ＮＥＤＤ４－１特异性干扰慢病毒载体构建逡逑３．１技术路线逡逑线性化载体由限制性酶消化得到，用ＰＣＲ扩增制备目的基因片段。逡逑７逡逑
目的基因片段及线性化载体通过重组反应实现体外环化。反应体系逡逑由线性化载体和目的基因扩X棽锱渲贫伞Ｍü校茫壹ㄆ桨迳系牡タ寺。义隙匝粜钥寺〗胁庑颍苯幼刈椴铮⒔薪峁治觯迹保病ｅ义希常彩笛椴牧襄义希常玻惫ぞ咴靥邋义显靥迕疲海牵郑保保担诲义希稿义
本文编号：2668678
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