脂多糖诱导的内皮源性外泌体介导心肌细胞损伤的研究

发布时间：2020-05-21 20:43

【摘要】：目的:脓毒血症(Sepsis)是感染引起的宿主反应失调,且危及生命的器官功能障碍的一种临床综合征,通常继发于严重感染、缺血再灌注损伤、创伤、休克等。细菌性脓毒血症的主要致病因素是内毒素,由各种病原菌主要是革兰氏阴性菌侵入机体后裂解释放。内毒素的主要成分是脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS),它可促进炎性细胞释放大量的炎性因子,导致全身炎症反应瀑布式爆发,进而引起多器官功能障碍。脓毒血症病情进展迅速,病死率达到20%。脓毒血症合并心脏功能障碍称为脓毒血性心肌病(sepsis-induced cardiomyopathy;SIC),SIC病情凶险,死亡率达70%。关于SIC的研究虽不断深入,但其发病机制仍未明确。血管内皮细胞(Endothelial Cell,EC)遍布于全身血管内面,维持血液正常流动,同时也是血管壁重要的天然屏障。当机体受到各种伤害刺激时,如感染、缺血再灌注、创伤、休克等,EC是最先受到侵犯的细胞,致病因素突破血管内膜后对全身各组织器官产生影响。EC在受到刺激后会释放携带蛋白质、脂质和核酸等生物活性物质的细胞外囊泡(Extracellular vesicles,EVs),EVs介导细胞之间的信息交流,其中外泌体(exosomes)受到广泛关注。外泌体作为EVs的一个亚型,直径约40-100nm,可携带微小RNA(microRNAs,miRNAs)。人们已经发现miRNAs对心肌细胞的功能存在调控作用,并对其作用机制有一定的研究。本实验旨在探索脓毒血症时内皮源性外泌体所携带的miRNAs与心脏功能障碍的关系及机制。方法:我们采用酶消化法培养Sprague-Dawley大鼠胸主动脉EC,以LPS刺激EC,对照组用PBS代替LPS。6小时后,收集两组EC,采用miRNA测序筛选出差异性表达的miRNAs(FC1.5,P0.05)。检测发现LPS刺激后EC的miR-155-5p表达显著增高。通过低温差速离心法联合聚乙二醇沉淀法获取内皮源性外泌体,检测发现LPS刺激后EC源性外泌体中miR-155-5p表达也显著增高。原代培养乳鼠心肌细胞(cardiomyocytes,CMC),通过脂质体转染法将miRNA-155-5p转染至CMC,检测CMC中丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量和BAX/BCL-2蛋白相对表达量,CCK-8检测细胞活性,评估CMC氧化应激水平和细胞损伤程度。结果:1、通过胶原酶消化法分离及培养出的血管EC成熟度、活性及纯度均满足实验要求。通过胰蛋白酶联合II型胶原酶消化法,得到稳定可靠的、纯度高、活力强的CMC。2、低温差速离心法联合聚乙二醇沉淀法所提取的外泌体,纯度高、活性好,经电镜鉴定具有典型的外泌体特征。3、EC在LPS刺激下高表达多种microRNAs,其中miR-155-5p可通过外泌体释放到细胞外。4、在体外实验中,miR-155-5p介导乳鼠CMC的氧化应激且促进凋亡。结论:血管EC在受到LPS刺激时可产生富含miR-155-5p的外泌体,外泌体通过旁分泌作用或外周循环到达并作用于CMC,介导脓毒血症时CMC氧化应激并促进凋亡,这可能是脓毒性心肌病的重要原因。
【图文】：

免疫荧光染色,内皮细胞,标尺,心肌细胞

图 2.SD 大鼠胸主动脉内皮细胞免疫荧光染色结果（标尺：20μm）Figure.2. Immunofluorescence of SD rat thoracic aortic endothelial cells(bar:20μm)1.2 乳鼠心肌细胞（1）心肌细胞形态学观察在倒置显微镜下可见，刚分离出来的心肌细胞大多数为悬浮的不贴壁的圆球形，可见极少数的不规则形细胞；培养 24 小时后心肌细胞逐渐贴壁生长，呈梭形或多边形，折光度较强；培养 48h 后已贴壁的心肌细胞伸出伪足相互连接呈细胞簇（图 3）。

标尺,蓝色荧光,分离培养,横纹

图 3.乳鼠心肌细胞（标尺：10μm）Figure.3. Neonatal rat cardiomyocytes (bar:10μm)（2）心肌细胞的鉴定荧光显微镜下可见心肌细胞内的绿色骨架和蓝色荧光的细胞核，，肌横纹呈不规形，荧光分布一致，即分离培养的细胞为
【学位授予单位】：西南医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R459.7

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