VND3207对小鼠放射性肠损伤的防护作用及其机制研究

发布时间：2020-05-23 02:39

【摘要】：目的:在人体中,更新快速的小肠组织细胞和造血干细胞对电离辐射(Irradiation,IR)最为敏感,而与造血系统相比,电离辐射诱发的小肠结构与功能紊乱发生机制研究不够深入,缺乏有效的防治手段。因此,寻找低毒、高效、方便服用的肠道电离辐射损伤防治药物及阐明其相关机理一直是放射生物学领域热门话题之一。本课题组前期工作筛选了多种香兰素衍生物的电离辐射防护作用,发现丁香醛(VND3207)显著提高细胞电离辐射抗性、抑制细胞凋亡。本论文主要从VND3207对放射性肠损伤的防护效果和防护机制展开讨论。方法:(1)9 Gyγ射线全身照射6-8周龄C57BL/6J小鼠,照前0.5小时灌胃给予VND3207(100 mg/Kg)或溶剂对照,照射后记录小鼠的生存状态,绘制生存和体重曲线;并在不同时间点取肠道制备病理学切片,通过HE染色观察VND3207对小鼠肠道病理形态学的影响,同时,应用TUNEL凋亡检测试剂盒和cleaved caspase-3免疫组化染色检测小鼠肠道隐窝细胞凋亡的情况,并用Ki67的免疫组化染色观察小鼠隐窝的增殖情况。另外,使用人源的肠上皮细胞(HIEC-6)做体外实验的验证,CCK-8实验检测不同浓度的VND3207对HIEC-6细胞毒性;应用EDU试剂盒检测VND3207对受照后细胞的增殖影响;明确VND3207对放射性肠损伤的防护效果。(2)应用基因表达谱芯片筛选单纯照射组和VND3207联合照射组之间的差异表达基因,q RT-PCR对其中的一些差异表达基因Slc5a4a、Akr1c14、Maob、Nfkbia、Gadd45g和Pmaip1进行了验证。筛选出VND3207靶向基因及其所在区域,对其进行简要地分析,并使用免疫组化的方法探索VND3207对辐照后的小鼠肠道组织中Noxa相关信号分子的表达影响。(3)VND3207预处理C57BL/6J小鼠半个小时后,给予9 Gyγ射线进行全身照射,并在照后不同时间点取小肠组织,检测照后3.5 d和7 d的小肠组织中的氧化应激水平。并通过8-OHdG和γ-H2AX的组织免疫荧光染色观察小肠隐窝细胞DNA的氧化损伤和双链断裂损伤;同时,在细胞水平上采用γ-H2AX的免疫荧光检测DNA的损伤修复;Western blot检测VND3207对肠上皮细胞中的DNA-PKcs自磷酸化的影响;探讨在肠道组织和细胞中,VND3207调控辐射诱发的DNA损伤及功能分子的修复机制。结果:(1)与单纯照射组相比,VND3207显著的改善小鼠的体重并明显延长9Gyγ射线照射的C57BL/6J小鼠的存活时间,显著提高其存活率,有效保护电离辐射引起的肠组织结构损伤,在降低小肠隐窝细胞凋亡率的同时促进肠隐窝细胞的增殖。(2)小鼠肠道组织基因芯片分析发现VND3207可显著调控多种基因的表达及信号通路,进而免疫组化分析结果显示VND3207通过调控小鼠肠道组织中p53蛋白的磷酸化修饰,进而抑制Noxa蛋白表达,并缓解了辐射引起的凋亡。GO富集分析表明了VND3207参与维持肠道微生物的稳态,初步阐述VND3207对放射性肠损伤的防护机制。(3)通过检测小鼠肠道组织的抗氧化活性和DNA损伤指标揭示了VND3207可以降低肠道中的氧化应激水平,缓解辐射诱发的DNA氧化损伤和DNA双链断裂损伤,在细胞水平上,同样应用免疫荧光染色标记γ-H2AX和Western blot分析DNA-PKcs的自磷酸化水平,分析结果显示,VND3207显著抑制γ-H2AX的形成,以及促进DNA损伤修复关键分子DNA-PKcs的自磷酸化。表明VND3207可能参与DNA的NHEJ修复,对辐照后小鼠肠道组织的重建过程做出重要的贡献。结论:本研究证实VND3207对放射性肠损伤的保护作用,缓解放射性肠损伤症状,揭示了VND3207对放射性肠损伤的防护机制可能有三个方面:一是参与调控小鼠肠道组织中p53磷酸化激活,抑制Noxa诱导的细胞凋亡;二是降低辐射引起的氧化应激水平,从而抑制小鼠肠道组织的DNA氧化损伤和双链断裂损伤;三是可能通过参与调控DNA-PKcs的自磷酸化,促进受辐照损伤DNA的NHEJ修复。本研究为揭示放射性肠损伤发生、发展机制提供新的理论与实验依据。
【图文】：

第一部分 VND3207 对小鼠放射性肠损伤的防护作用及其机制研究分析结果显示，如图 1.1A 单纯照射组的小鼠在第四天就开始逐渐死亡，至第13 天全部死亡，而 VND3207 联合照射组的小鼠至第 10 天才开始出现死亡，观察至第 30 天时仍有 40% 的小鼠存活，且数据分析结果具有显著的统计学意义（P<0.001）由此说明 VND3207 联合照射组与单纯照射组小鼠相比存活时间显著延长；虽然在照射后初期各组小鼠的体重都相对减轻，但单纯照射组小鼠的体重降低的较快，而 VND3207 联合照射组小鼠体重在照后 15 天达到最低，随后存活的小鼠体重开始逐渐的恢复（图 1.1 B）。这表明 VND3207 可以改善照后小鼠的生活状态和体重变化。

图 1.2-1 VND3207 对辐照后小鼠肠道形态结构的影响A. C57BL/6 小鼠被给予 9 Gyγ 射线的全身照射，照后 3.5 d 小肠组织形态结构图；B. 小鼠绒毛长度和隐窝深度定量分析（**p < 0.01, ***p < 0.01, n = 6）。隐窝数目和深浅的变化与隐窝细胞的增殖情况密切相关，据研究表明，在小鼠肠道受照射后的 3.5 d，隐窝细胞增殖最为明显，为此我们采用免疫组化染色分析 3.5 d 取样的肠道组织中 Ki67 的表达情况，Ki67 标记的是处于增殖周期中的细胞，该标记阳性率越高，组织的增殖速度越快[5]。如图 1.2-2 C，γ 射线照射前，对照组和 VND3207 组小鼠肠道隐窝处的 Ki67+细胞数无明显差异。而照射后，单纯照射组中的 Ki67+细胞数明显减少，VND3207 联合照射组中处于细胞周期所有活跃期的细胞数目显著增多。通过对小鼠肠道横切面每周的阳性隐窝数和 Ki67+细胞数进行计数统计分析(图 1.2-2 D 和 E)，发现 VND3207 联合照射组中阳性隐窝数增至 105±9（单纯照射组 61±4），Ki67+细胞数增至 30±1（单纯照射组 16±1），两者差异均具有统计学意义（P<0.001）。由此结果说明，，VND3207 可以促进小鼠
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R730.55

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本文编号：2677010