抗TNF-α纳米抗体的制备及在电化学免疫传感器中的应用

发布时间：2020-05-26 18:24

【摘要】：肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factorα,TNF-α)一种由免疫细胞分泌出来的炎症因子,用于调节免疫系统。临床研究表明TNF-α的高水平表达与炎症反应、心血管疾病、自身免疫性疾病等相关。TNF-α是重要的生物标志物,已作为某些疾病预后、临床治疗的监测指标。纳米抗体(Nanobody,Nb)是通过克隆驼源抗体中的重链可变区基因而获得一种基因工程抗体,是已知最小的抗体,分子量为15 KD。研究表明纳米抗体具有特异性强、稳定性好,易表达等优点,可用于检测、治疗等领域。电化学免疫传感器是通过将抗原抗体反应的生物信号用电信号的形式加以放大,从而实现高灵敏性检测,已被广泛用于肿瘤标志物、毒素等的检测。本研究采用噬菌体展示技术构建了抗TNF-α纳米抗体噬菌体展示文库。通过3轮生物亲和淘选的方法得到37株阳性噬菌体克隆,利用基因工程技术将其中三个抗TNF-α纳米抗体(NbA26、NbB5、NbC13)在大肠杆菌中进行了表达。经酶联免疫吸附测试实验鉴定后,结果显示纳米抗体NbB5具有更好性能,将其作为制备电化学免疫传感器的元件,通过构建的电化学免疫传感器实现对TNF-α的高灵敏检测。主要研究结果如下:1.用TNF-α抗原对羊驼采取多点免疫,三次免疫结束后采集了50 mL驼外周淋巴血,分离白细胞,提取得到了总RNA。经巢式PCR、酶切、电转化等系列实验,获得库容为1.2×10~8的抗TNF-α纳米抗体噬菌体展示文库,目的基因插入的正确率为100%,经辅助噬菌体M13KO7救援后,噬菌体文库滴度为3.2×10~(13) cfu/mL。2.通过三轮噬菌体文库淘选,并用phage-ELISA方法对噬菌体克隆进行了鉴定。从文库中挑选出了150个克隆,筛选到37株阳性抗TNF-α纳米抗体噬菌体,编号为A1、A4、A7、A13、A15、A22、A24、A25、A26、A28、B4、B5、B6、B7、B8、B13、B14、B17、B18、B32、B41、B50、C1、C4、C5、C9、C13、C16、C24、C27、C28、C29、C30、C31、C32、C33、C34。测序后进行比对分析,共获得了20种纳米抗体序列。3.提取了编号为A26、B5、C13的噬菌粒,使用Sfi I、Not I酶切,得到VHH目的片段后重组至pET25b中。分别构建了pET25b-NbA26、pET25b-NbB5、pET25b-NbC13重组载体,且成功转化至大肠杆菌Rosetta中,成功实现纳米抗体NbB5、NbA26、NbC13的表达。ELISA进行鉴定,结果表明纳米抗体NbB5亲和力最高,特异性更好,选择NbB5作为后续构建免疫传感器的检测元件。4.通过MPA法将单克隆抗体固定于金电极作为捕获抗体,TNF-α被捕获后,NbB5作为检测抗体,并利用HRP酶进行信号放大,成功构建了双抗夹心模式的电化学免疫传感器。用该传感器检测血清中的TNF-α,其最低检测限为8 pg/mL,检测范围为0.01~5 ng/mL。通过加标回收实验分析准确性,加标回收率为90.05~123.33%,变异系数为13.51~15.05%。
【图文】：

示意图,噬菌体文库,试剂,示意图

图 2.1 噬菌体文库构建方法示意图Fig 2.1 Outline of strategies to construct the phage display library.1 实验试剂与仪器

血清,淋巴细胞,羊驼,试剂

图 2.2 血清中抗体效价的测定Figure 2.2 Measurement of antibody titers in serum2.3.2 淋巴细胞和总 RNA 的提取TNF-α 抗原免疫羊驼三次后采血分离淋巴细胞，用 Trizol 等试剂提取其总
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R446.6;TP212

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