四种核酸提取磁性纳米颗粒的研制及其应用

发布时间：2020-05-29 19:54

【摘要】：目的研制Fe_3O_4、PDA@Fe_3O_4、SiO_2@Fe_3O_4、CTA@Fe_3O_4四种氧化铁纳米颗粒,检测其理化性能,优化并评价四种磁珠法基因组DNA提取纯化体系,同时评价不同修饰基团的磁性纳米颗粒提取的基因组DNA对高分辨熔解曲线(HRM)进行SNP基因分型能力的影响。方法采用水热法制备四氧化三铁(Fe_3O_4)纳米颗粒内核,再通过化学修饰分别将聚多巴胺(PDA)、二氧化硅(SiO_2)及壳聚糖(CTA)包覆于纳米氧化铁磁珠表面。通过透射电子显微镜(TEM)、X射线衍射(XRD)、傅立叶红外光谱(FT-IR)、振动样品磁强计(VSM)和Zeta电位测定等分析技术对Fe_3O_4、PDA@Fe_3O_4、SiO_2@Fe_3O_4和CTA@Fe_3O_4磁珠的微观形貌和理化性能进行表征。以离心柱提法为对照,采用独立样本t检验进行统计学处理,评价修饰磁珠及裸核磁珠提取DNA的得率和纯度,并计算最大提取能力。针对rs2302515CG,rs12641369GA、rs2725252GT和rs3114018CA 4个SNP位点,分别取上述方法提取的DNA作为模板进行PCR-HRM检测;以Sanger测序作为金标准,评价检测的灵敏度和特异性;通过重复性实验评价其重复性和再现性。结果(1)在透射电子显微镜观察四种纳米氧化铁磁珠,呈球形颗粒状,形态大小基本一致,粒径在100 nm左右,分布较分散;XRD检测结果显示其衍射峰位置与标准参数相一致,对应于的晶面指数为(220),(311),(400),(422),(511)和(533),没有其它杂质峰出现,产物均为单相立方晶型;红外光谱结果显示PDA@Fe_3O_4的特征吸收峰在3418 cm~(-1),2922 cm~(-1),1466 cm~(-1)和876 cm~(-1)处;SiO_2@Fe_3O_4的特征吸收峰在1082 cm~(-1)处;CTA@Fe_3O_4的特征吸收峰在1648cm~(-1)、1603 cm~(-1)和1385 cm~(-1)处,证明多巴胺、二氧化硅和壳聚糖被成功修饰在磁珠表面,并且通过静电力、氢键和范德华力等方式结合。磁滞回线结果显示四种磁珠的磁化强度在场强为-2500 Oe时开始提高,-2000 Oe~2000 Oe区间提升最为明显,在3000 Oe时基本达到饱和程度,Fe_3O_4、PDA@Fe_3O_4、SiO_2@Fe_3O_4和CTA@Fe_3O_4的饱和磁化强度值分别为71.5 emug~(-1)、40.7 emug~(-1)、46.5 emug~(-1)和58.9 emug~(-1);Zeta电位测定结果显示,随着溶液pH增加,Zeta电位值均逐渐降低,Fe_3O_4、PDA@Fe_3O_4、SiO_2@Fe_3O_4和CTA@Fe_3O_4在体系中的等电点分别为5.0、5.5、7.2和6.5。(2)五种核酸最优化提取体系的提取质量结果显示,PDA@Fe_3O_4的核酸得率比离心柱法高(P0.05);SiO_2@Fe_3O_4法提取得率与离心柱法相当,且差异无统计学意义(P0.05);CTA@Fe_3O_4法及Fe_3O_4法DNA提取得率均比柱提法低,且具有显著性差异(P0.01);PDA@Fe_3O_4法、SiO_2@Fe_3O_4法和CTA@Fe_3O_4法、Fe_3O_4法与柱提法相比A260/A280比值无统计学差异(P0.05);PDA@Fe_3O_4法、SiO_2@Fe_3O_4法和CTA@Fe_3O_4法和Fe_3O_4法(1.60±0.14)的A260/A230比值比柱提法低,差异具有统计学意义(P0.01)。Fe_3O_4法、PDA@Fe_3O_4法、SiO_2@Fe_3O_4法和CTA@Fe_3O_4法对DNA的最大吸附能力分别为23.3 mg/g、116.7 mg/g、96.4 mg/g及48.3 mg/g。(3)检验性能评价结果显示,除2例样本的熔解曲线均发生飘移接受复查外,其余标本均可直接基因分型;四种核酸提取方法的最终分型结果灵敏度和特异性均达到100%。在重复性实验中,四种核酸提取方法及SNP位点对应的熔解曲线Tm值的CV均在0.04%~0.15%之间;在再现性实验中,四种磁珠核酸提取法SNP位点对应的熔解曲线Tm值的CV均在0.07%~0.32%之间,尽管批间的熔解曲线有轻微的波动,但不影响基因正确分型。4个位点10次批内和10次批间重复试验均显示重复性和再现性良好。统计学分析显示除rs2302515CG外,rs12641369GA、rs2725252GT和rs3114018CA的纯合型与野生型Tm值均存在显著性差异(P0.01),即可明确区分不同纯合基因型。结论本研究成功制备了四种可用于核酸提取的磁性纳米颗粒,自建的四种磁珠法核酸提取体系对PCR-HRM检测结果的影响很小,可对rs12641369GA、rs2725252GT、rs3114018CA、rs2302515CG 4个SNP位点进行常规化基因分型,且具备良好的检测性能,具有一定的临床应用价值。
【图文】：

四种磁性微粒同样采用 2.3.3.1 中的提取体系操作步骤公式进行体系优化，共分为四组。实验室质量控制珠法核酸提取体系及 PCR-HRM 检测体系均在分析检测过程中设阴性对照及阳性对照；所有实验步骤均按照标准实验程序进行；为差的影响，，记录离群样本，剔除离群值，计算用于评价方法精密度同修饰的磁珠提取核酸效果的比较了评价四种基于磁性复合颗粒核酸提取体系对分离人全血基因组研究将对比不同核酸提取体系的提取率、最大吸附能力、核酸得率差异。种不同修饰磁性微粒提取全血基因组 DNA 的基本流程

19图 3.1 四种磁性纳米颗粒的 TEM 图a、b、c、d 分别表示 Fe3O4、PDA@Fe3O4、SiO2@Fe3O4和 CTA@Fe3O4 图。研究通过水热法合成的多巴胺、二氧化硅、壳聚糖修饰的四氧化三颗粒的透射电子显微镜表征图像如图 3.1 所示，通过 a、b、c、d 可以清晰，四种磁性微粒的成球性均较好，粒径约为 100 nm 左右，分布较均匀，团聚现象。b、c、d 图中的黑色箭头表示修饰物质（PDA、SiO2、CTA）磁珠上的部分。TEM 结果表明研究成功制备出大小均一、形态良好的四铁微粒，并且将多巴胺、二氧化硅及壳聚糖成功的包覆在氧化铁粒子表面
【学位授予单位】：兰州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R440;TB383.1

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本文编号：2687410