基于纳米抗体及纳米金—介孔碳复合物对CP4-EPSPS蛋白的电化学免疫传感研究

发布时间：2020-05-30 08:38

【摘要】：研究目的:近年来由转基因农作物所带来的生态安全性问题,以及对人体健康可能存在的潜在风险引起了人们高度的关注。而针对转基因蛋白却并没有许多高效灵敏的检测方法。为此,本研究利用纳米金-介孔碳复合物作为电化学探针硫堇的载体并用纳米抗体代替传统单克隆抗体,构建了一种新型电化学免疫传感器,从而实现对抗草甘膦的转基因蛋白CP4-EPSPS的高灵敏高选择性定量检测。研究方法:首先,我们制备了纳米金(AuNPs),并将纳米金(AuNPs)和有序介孔碳(OMC)以不同质量比制备复合物,选择性能最佳的比例复合物作为电化学探针的载体用作传感器的基底复合物,并对材料进行了表征分析如透射电镜(TEM)、扫描电镜(SEM)等,同时将纳米抗体(Nb)与普通抗体的性能如热稳定性做了对比验证;然后,将基底复合物滴加在玻碳电极表面并在此基础上逐步修饰一定浓度比的Nb和硫堇(Th)的混合物、不同浓度的CP4-EPSPS蛋白溶液以及后续实验所需试剂来构建电化学免疫传感器,构建过程中通过循环伏安法(CV)监测传感器构建是否成功,传感器构建成功后利用差分脉冲伏安法(DPV)实现对CP4-EPSPS蛋白的定量检测,并根据不同浓度CP4-EPSPS蛋白所对应的实验数据拟合出标准曲线得出方程;最后,通过特异性、重现性、稳定性以及加标回收等实验来验证本方法的可行性。研究结果:TEM测得制备出的AuNPs粒径大小约为13 nm,质量比分别为1:5、2:5、3:5、4:5的AuNPs-OMC复合物被成功制备后,通过电化学实验得出质量比为2:5的复合物具有最佳的电化学活性;TEM和SEM结果显示质量比为2:5的AuNPs-OMC复合物中AuNPs均匀地附着在OMC表面,比表面积测试(BET)测得其具有1125 m~2/g的比表面积;纳米抗体与普通抗体的对比实验结果显示出纳米抗体优越的热稳定性;通过对DPV实验数据的分析,拟合所得的标准曲线方程为(I_0-I_i)/I_0=0.0754LgC(ng/mL)+0.3628,线性相关系数约为99.3%,并得出本方法对CP4-EPSPS蛋白的检测线性范围为0.001 ng/mL到100 ng/mL,检测限(LOD)值为0.72 pg/mL;另外,本方法对CP4-EPSPS蛋白的响应信号比其他转基因蛋白高出5倍之多,组间重现的相对标准偏差(RSD)为4.2%,传感器放置14天后响应信号仍保持在80%以上,加标回收的回收率范围为96.18%到102.7%,所测得的浓度值与实际浓度值偏差小于3.6%。研究结论:我们通过耦合Nb、OMC和Th,开发了一种具有高灵敏度和高效率的简单电化学免疫分析方法,实现了对目标抗原CP4-EPSPS蛋白的超灵敏定量检测。OMC不仅具有优良的导电性和较大的比表面积,而且其通过与AuNPs的复合反应形成的AuNPs-OMC复合物能够为捕获剂和电化学探针提供丰富的结合位点。本方法对CP4-EPSPS蛋白呈现出宽的检测范围、较高的检测灵敏度和特异性、高的稳定性以及令人满意的重现性和可靠性,是一种非常有实际意义和应用前景的转基因作物筛选及检测新方法。
【图文】：

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东南大学硕士学位论文传感探针的信号，使得免疫传感器的检测灵敏度得到了大幅度的提升。此外，我们利用纳米抗体作为捕获抗体，硫堇（Th）作为电化学传感的信号探针，最终开发出一个具有高灵敏度和高特异性的 CP4-EPSPS 蛋白的检测新方法，，检测示意图如图 1 所示。这种免疫传感系统不仅可以用于 CP4-EPSPS 蛋白的检测，还可以通过改变相应的抗体来检测其他的生物标志物，能够广泛地应用于食品安全和医学诊断等领域。

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第一章纳米材料的制备及表征3 实验结果及分析3.1 AuNPs 的制备AuNPs 主要是通过采用还原剂如柠檬酸钠、硼氢化钠等还原氯金酸所制得的金纳米粒子。在制备过程中通过控制反应条件、试剂用量，可得到单分散性很好的金颗粒。本实验纳米金的制备方法参考 DidierAstruc 等人的综述文献[88]，在对氯金酸加热的过程中不停地搅拌，并在高温条件下快速加入柠檬酸钠并持续搅拌，这使得还原反应能够快速发生，氯金酸迅速成核，从而生成大量的粒径较小且分布均一的金纳米颗粒。
【学位授予单位】：东南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R446.6;TP212.3

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