新型荧光微球的制备、分子动力学模拟及其在心肌梗死标志物免疫层析检测中的应用研究

发布时间：2020-05-30 14:32

【摘要】：心血管疾病(Cardiovascular diseases,CVDs)是全世界范围内致死的头号原因,每年死于CVDs的死亡人数多于任何其他原因死亡的人数。心肌梗死(Myocardial infarction,MI)是缺血性心脏病的常见表现,据《中国心血管报告2017》显示,近15年来,我国的心肌梗死死亡率总体情况呈现上升趋势,并且个体发病率呈现年轻化。因此,能够有效提前检测MI标志物,预测MI的发生与发展,对于潜在患者的预防与救助救治都具有非常重要的意义。本论文利用免疫层析技术(Lateral flow immunoassay,LFIA),针对心肌肌钙蛋白I(Cardiac troponin I,cTnI)和C反应蛋白(C-reactive protein,CRP),基于纳米载体理论开发了一种快速检测技术应用于MI标志物的临床检测。采用一步法合成具有明显功能性区域划分的核壳结构纳米微球,通过调控实验参数结合分子动力学模拟技术研究了微球的合成机理;通过测定荧光染料对抗体蛋白二级结构的影响作用探讨了荧光染料与检测方法学稳定性的关系;构建了红色和绿色荧光微球体系用于cTnI和CRP的临床快速检测,解决了检测平台开发过程中的关键技术问题,有效地提高了检测方法的灵敏性与稳定性,具有重要的理论意义与实用价值。本论文使用免疫学、高分子化学和材料学知识,结合计算机模拟技术,系统地研究了抗体合成,荧光免疫微球合成与制备,检测卡组装与仪器调试,临床真实样品检测等整个检测平台开发过程中的科学问题与技术难题,主要研究结果如下:(1)获得3株稳定分泌抗cTnI单克隆抗体(cTnI-Monoclonal antibodies,cTnI-McAb)的阳性杂交瘤细胞,通过小鼠单抗IgG类/亚类检测试剂盒鉴定出3株抗体的亚型均为IgG1,抗体在4℃和-20℃保存6个月后仍保持良好的稳定性。(2)通过调控实验参数(引发剂、功能性单体、反应温度和搅拌速度),制备了粒径范围从200 nm到600 nm,形貌均一,分散性良好的羧基功能化聚苯乙烯微球。微球具有明显的核壳结构,球体内部为聚苯乙烯核心,可以有效包裹荧光染料,外层为具有羧基功能化的聚丙烯酸外壳用于连接抗体蛋白,微球功能区域划分明确,有利于荧光染料的负载与抗体的结合。(3)利用溶胀分散技术,制备了以尼罗红(Nile red,NR)和异硫氰酸荧光素(Fluorescein isothiocyanate,FITC)为荧光染料的荧光纳米微球,荧光最大发射波长分别为606 nm和520 nm;使用傅立叶变换红外光谱和热重分析技术,表征了羧基聚苯乙烯微球(Carboxyl polystyrene nanoparticles,CPNs),羧基聚苯乙烯红色荧光微球(Red fluorescence-CPNs,R-CPNs)和羧基聚苯乙烯绿色荧光微球(Green fluorescence-CPNs,G-CPNs)的官能团变化和热重学信息,进一步证明了荧光染料与聚苯乙烯微球的良好结合;使用圆二色谱探讨了NR和FITC与抗体蛋白二级结构的关系,为研究荧光免疫分析方法的稳定性和重复性提供理论支持。(4)使用计算机模拟技术,构建了聚苯乙烯,丙烯酸,NR和FITC的稳定分子构象,计算了所有参与反应分子的溶解度参数以及各个分子之间的相互作用参数;通过耗散动力学方法演绎了微球的合成过程,主要包括3个阶段:初期合成材料均匀分布,中期形成小型聚合体,后期形成大型聚合体最终形成稳定的微球构象;研究了4种溶剂对于荧光染料在微球中的密度分布情况,为微球的制备与优化实验结果提供理论支持,同时为构建新型功能化纳米微球提供新思路与新方法。(5)研究了R-CPNs与G-CPNs在cTnI检测上的应用。R-CPNs/G-CPNs与抗cTnI单克隆抗体(cTnI-McAb1)发生偶联反应之后仍能保持形态均匀,单分散系数(Polydispersity Index,PDI)分别为0.057与0.062,呈现单分散状态;在偶联过程中,微球与cTnI-McAb1的最佳偶联时间为120 min,偶联反应的优化抗体浓度为500μg/mL;样品检测过程中,优化的免疫反应时间为15 min;经过优化的NR-LFIA的检测卡对cTnI的检测限(Limit of detection,LoD)为0.016 ng/mL,检测范围为0.016-80 ng/mL,FITCLFIA检测卡对cTnI的LoD为0.18 ng/mL,检测范围为0.18-80 ng/mL,检测卡具有出良好的特异性、重复性和稳定性,可应用于临床样品的检测。(6)研究了R-CPNs与G-CPNs在CRP检测上的应用。在与CRP-McAb1发生偶联反应之后,免疫红色荧光微球(Immune-R-CPNs,Im-R-CPNs)和免疫绿色荧光微球(Immune-G-CPNs,Im-G-CPNs)形态都保持均匀,PDI分别为0.048与0.059,呈现单分散状态;微球与CRP-McAb1的最佳偶联时间为75 min,偶联反应的优化抗体浓度为300μg/mL;样品检测过程中,优化的免疫反应时间为3 min;使用pH 6.5的2-(N-吗啉)-乙烷磺酸(2-(N-morpholine)-ethane sulphonic acid,MES)作为抗体与微球之间偶联反应过程的缓冲液,能有效的保持共轭体系生成之后的稳定性;NR-LFIA的检测卡对CRP的LoD为0.091 mg/L,检测范围为0.1-160 mg/L,FITC-LFIA检测卡对CRP的LoD为0.37 mg/L,检测范围为0.4-200 mg/L,检测卡具有出良好的特异性、重复性和稳定性,可应用于临床样品的检测。
【图文】：

时间轴,特异性,肌钙蛋白,生物标志物

[9]。在心肌肌钙蛋白应用于 AMI 的检测之后，Myo 已不再推荐为心肌坏死早的检测[10-11]。由于电泳的发展，得以检测 CK 的心脏特异性同工酶，即 CK-MB[骼肌（1％）相比，CK-MB 在心肌具有更高的水平（25-30％）。近二十年来，志物的分析在 AMI 的诊断中发挥了重要作用，并于 1979 年被世界卫生组织列AMI 的诊断标准之一[13]。然而，缺乏特异性和假阳性结果的高比率限制了它们。AMI 的诊断需要更多的心脏特异性生物标志物。1965 年，学者发现了一种肌原纤维蛋白成分，随后被称为肌钙蛋白[14]。由于其对心肌具有高度敏感性和已被推荐为诊断心肌梗死的首选生物标志物[15]。同时，CK-MB 对急性心肌损度的特异性，已不被推荐为单独诊断 AMI[16]。此外，对炎症与心血管疾病的研活动性炎症可引起心脏动脉内壁的斑块破裂从而导致冠状动脉内血栓的形成，其应蛋白（C-reactive protein，CRP）与此现象密切相关，可作为辅助对 AMI 进7]。

示意图,试纸条,示意图,高灵敏度

得到迅速发展，，但仍然没有像葡萄糖生物传感器或他分析物（如蛋白质、DNA 等）的低成本和高效的于“纸”的生物传感器-免疫层析技术（lateralflowim量的研究。LFIA使用的主要材料是由纤维素或硝材料，为传感器的研发提供了许多优势。LFIA 试所示：样品垫、结合垫、由硝酸纤维膜组成的检测眼检测或使用简单光学仪器对分析物进行检测的限、灵敏度高、稳定性高、需要的样品量少、不需友好，只需要一步操作即可获得检测结果。然而，IA 也存在一些弱点，例如用裸眼判断只能获得定性高灵敏度和精确的定量[70]。因此，研究人员开发了子点、上转换发光材料、镧系元素等），以提高传统着定量、多标记检测、高灵敏度等方向发展。
【学位授予单位】：华南理工大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R542.22;R446.6;O657.3

【参考文献】