超灵敏生物传感体系在蛋白质检测中的构建与应用

发布时间：2020-05-31 09:42

【摘要】：近年来,随着科学技术的发展,蛋白质的检测技术对于医疗诊断、药物开发、生态安全等领域越来越重要。传统的免疫反应检测方法灵敏度低,特异性差。在这种情况下,蛋白质传感器由于其高灵敏度、低成本及高稳定性等优点受到越来越多的关注。基于此,我们构建了两种蛋白质传感体系。第一种是基于独特的金属-配体电荷转移(MLCT)作用下的比色分析法检测碱性磷酸酶(ALP)活性。在ALP的作用下,底物抗坏血酸磷酸酯(AAP)被催化水解生成抗坏血酸,抗坏血酸可还原Cu2+变为Cu+。随后,Cu+与二喹啉甲酸(BCA)结合生成显色络合物Cu(BCA)+,溶液颜色也由无色变为紫色,并在562nm波长处有明显吸收峰。该方法快速简便,可通过肉眼定性观察判断ALP活性水平,同时,在0-200 mU mL-1的范围内有很好的线性范围,检测限达到1.25 mU mL-1。结果表明该方法具有良好的选择性,在筛选抑制剂上也有很大潜力。更重要的是,该方法在检测未稀释的人体血清样品的ALP水平时也表现出很好的检测性能。第二种是基于末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)引发聚合的超灵敏检测蛋白质芯片生物传感器。利用两个不同的凝血酶适配体来捕获凝血酶分子,形成三明治结构来提高传感器的特异性识别。其中一个末端修饰氨基的适配体固定在预处理后的硅基芯片表面,另一个适配体的3'末端暴露在硅片表面,利用TdT酶催化加尾的性质在适配体末端添加聚合带有荧光素标记的dATP作为信号放大。在最优试验条件下,该三明治结构的生物传感器在100 fM到0.1 μM的检测范围内均有良好的线性关系,检测下限达到8.35 fM。此外,该传感器在人血清样品中对凝血酶也有较好的检测分析性能。以上两种检测体系均具有较高的灵敏度和选择性,操作简便,成本较低,可广泛应用于疾病诊断、临床预后、环境监测等领域。
【图文】：

示意图,检测方法,原理,示意图

．２．２实验仪器逡逑ＣＨＩ７６０Ｄ电化学工作站（上海），使用０．５ＭＫＮＯ３溶液作为支持电解质，玻碳电极（ＧＣＥ（５邋＝邋３ｍｍ）作为工作电极，饱和甘汞电极（ＳＣＥ）作为参比电极，铂丝作为对电极。紫外分光逡逑度仪（岛津ＵＶ－３６００），ｌｃｍ光程的微量比色皿用于检测。超纯水仪（密理博Ｍｉｌｌｉ－Ｑ）。逡逑．２．３实焌骤与方法逡逑．２．３．１实验原理逡逑碱性磷酸酶活性的检测原理如图１所示。碱性磷酸酶的催化作用可以促进ＡＡＰ磷酸根的逡逑解，生成的抗坏血酸（ＡＡ）具有还原性，从而将溶液中的二价铜离子还原成一价铜离子。逡逑价铜离子与配体ＢＣＡ络合形成Ｃｕ邋（ＢＣＡ）２＋的配合物作为显色探针，会使溶液呈现明显的紫逡逑，通过检测紫外可见吸收光谱在５６２邋ｎｍ的波长处有特征峰，吸光系数为７７００邋ｃｎ＾Ｍ４。［４４］逡逑二价铜离子与ＢＣＡ在一起时则没有明显颜色。颜色深浅与其紫外可见吸收光谱上吸光度即逡逑反应出溶液中ＡＬＰ的浓度。据此构成一个用于检测ＡＬＰ浓度的比色分析的生物传感器。逡逑ＯＨ逡逑°

可行性分析

２．３结果与讨论逡逑２．３．１可行性分析逡逑为了验证该传感器的可靠性与可行性，通过单一变量的方法进行研究，如图２所示。将逡逑ＡＬＰ、ＡＡＰ、Ｃｕ２＋和ＢＣＡ各组分分别去除与原反应结果进行对比，，比较对照组与实验组紫外逡逑可见吸收光谱的异同。明显可见，在各组分都加入反应溶液的情况下在５６２邋ｎｍ处有一个明显逡逑的吸收峰，而缺少了邋ＡＬＰ、ＡＡＰ、ＢＣＡ、Ｃｕ２＋或Ｃｕ２＋／ＢＣＡ的情况无明显特征峰。另外，有ＢＣＡ逡逑存在的情况下，在３７０邋ｎｍ处有较强的吸收峰。通过实验发现，在３７０邋ｎｍ处的吸光度与ＢＣＡ逡逑配体的浓度有关，因此可以判断出３７０邋ｎｍ处为ＢＣＡ配体的特征吸收峰。而在各组分完全的情逡逑况下，反应结束后溶液变为紫色，可以通过肉眼观察比较颜色深浅来对ＡＬＰ浓度进行定性检逡逑测。所以该传感器的反应体系由于ＡＬＰ酶的催化性能，水解出的ＡＡ将二价铜离子还原为一逡逑价铜离子
【学位授予单位】：南京理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R446.1

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