SRC样受体通过负调控ADAM12增加非小细胞肺癌放疗敏感性的机制研究

发布时间：2020-06-01 01:17

【摘要】：目的:在世界范围内,肺癌是造成癌症相关死亡的主要癌症之一,其中非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)占据了肺癌总数的百分之八十左右。因为大多数患者确诊较晚,在临床治疗中失去了手术医治的时机,患者接受传统的放化疗治疗和靶向药的治疗来对抗癌症。C-SRC是酪氨酸激酶家族中重要的一员,它很少发生突变并且在50-80%的肺癌患者中高表达,是黏着斑激酶(FAK)复合体中的一部分,调控细胞的黏附和迁移,在肺癌的进展和转归中起到了重要的作用,并且C-SRC蛋白介导了肺癌放疗抵抗的产生。ADAM12,解整合素-金属蛋白酶12,在肺癌中通过调整肿瘤细胞的上皮细胞间充质转化(EMT)水平参与癌症进程的进展,而EMT作用会进一步促进肺癌的耐药性和放疗抵抗的获得。SRC样受体蛋白(SLAP)属于造血因子受体亚族,生物学作用为阻滞细胞内信号传导。SLAP有一个独特的连接着与SRC酪氨酸激酶家族高度同源的SH3和SH2末端的十八烷基化N尾端和一个同CBL紧密连接的独特的C-尾端。证据表明SLAP负调控癌症细胞中酪氨酸激酶的表达和活化。由于SLAP和C-SRC的SH2结构域具有高同源性,SLAP可以竞争结合与C-SRC相关的生长因子受体和有丝分裂信号通路受体。本研究的目的是研究SRC样受体蛋白(SLAP)通过抑制C-SRC蛋白的磷酸化活化,逆转非小细胞肺癌(NSCLC)在放疗治疗过程中获得的放疗抵抗能力的作用机制。研究方法:使用C-SRC抑制剂dasatinib处理A549,H1650,H460肺癌细胞系,并且使用6mv直线加速器对A549,H1650,H460细胞系和经过dasatinib预处理的A549,H1650,H460细胞系进行2Gy和2Gyx4(2Gy放疗两天一次连续四次)的放疗,观察各组细胞系的增殖和凋亡能力。通过慢病毒载体转染A549,H1650,H460细胞系,在72小时后使用嘌呤霉素筛选稳定过表达或者低表达ADAM12的A549,H1650,H460细胞系,并且在该细胞系稳定传代5代之后使用western blotting实验验证细胞系表达的ADAM12蛋白的水平。使用6mv直线加速器对A549,H1650,H460细胞系和过表达,低表达ADAM12的A549,H1650,H460细胞系进行2Gy和2Gyx4的放疗,放疗结束后48小时后使用CCK-8检测各组细胞的增殖能力,caspase3试剂盒检测各组细胞凋亡状况,Western blotting实验检测各组细胞ADAM12,C-SRC蛋白的表达情况,Elisa实验检测各组p-AKT表达情况。之后使用慢病毒载体构建SLAP过表达的A549,H1650,H460细胞系,进行2Gy和2Gyx4的放疗,使用CCK-8检测各组细胞的增殖能力,caspase3试剂盒检测各组细胞凋亡状况,Western blotting实验检测各组细胞ADAM12,C-SRC蛋白的表达情况,Elisa实验检测各组p-AKT表达情况。并且在过表达SLAP的A549,H1650,H460细胞系的基础上再敲减SLAP进行相关的挽救实验。将过表达后敲减掉SLAP的细胞系同阴性对照组和SLAP过表达组进行2Gy和2Gyx4的放疗,使用CCK-8检测各组细胞的增殖能力,caspase3试剂盒检测各组细胞凋亡状况,Western blotting实验检测各组细胞ADAM12,C-SRC蛋白的表达情况,Elisa实验检测各组p-AKT,pMTOR,Cleaved PARP1,CDK1,CD44表达情况,使用划痕实验测试细胞迁徙能力,使用transwell实验测试细胞侵袭能力。最后使用慢病毒在已经过表达或敲减SLAP的A549,H1650,H460细胞系中分别过表达和敲减C-SRC和AKT,并分别检测各组细胞系在接受2Gyx4的放疗前后AKT,p-AKT,E-cadherin,Vimentin的表达情况,使用划痕实验测试细胞迁徙能力,使用transwell实验测试细胞侵袭能力。结果:使用dasatinib处理过的A549,H1650,H460细胞系经过2Gy放疗后增殖能力明显降低,凋亡明显增加,但是经过2Gyx4的放疗后dasatinib失去了以上作用。经过WB检测发现经过2Gyx4的放疗后的A549,H1650,H460细胞系ADAM12表达增高,敲减ADAM12后A549,H1650,H460细胞系在2Gyx4的放疗后恢复了对dasatinib的药物敏感性。构建的过表达SLAP和过表达后敲减SLAP的A549,H1650,H460细胞系在经过2Gyx4的放疗后,在SLAP过表达组各个细胞系的ADAM12蛋白保持低表达状态,其增殖能力同对照组和过表达后敲减SLAP的各个细胞系组明显降低,凋亡情况增加,并且p-C-SRC,p-AKT,CDK1,CD44表达降低,p-MTOR,Cleaved PARP1表达升高,其侵袭能力和迁移能力明显减低。而过表达SLAP细胞系在敲减SLAP之后其生物学行为又回到了之前的水平。在各组稳定过表达SLAP的细胞系中过表达C-SRC和AKT导致其p-C-SRC和p-AKT上调,并且增强了细胞的迁徙能力和侵袭能力。在各组敲减SLAP的细胞系中敲减C-SRC和AKT导致其p-C-SRC和p-AKT下调,并且减弱了细胞的迁徙能力和侵袭能力。结论:C-SRC是治疗非小细胞肺癌的重要靶基因,C-SRC抑制剂dasatinib联合单剂量放疗可以增加细胞的凋亡和减低细胞的增殖能力。而连续2Gy放疗4次激活了肺癌细胞系中ADAM12蛋白的过表达,而ADAM12蛋白有促进上皮细胞间充质化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的能力,而EMT可以导致肿瘤细胞的放疗和化疗抵抗,并且促进肿瘤细胞的迁徙和侵袭。减低肺癌细胞系中ADAM12的表达可以增加肿瘤细胞在使用2Gyx4放疗治疗后对dasatinib的敏感性。过表达ADAM12蛋白则会逆转以上在肺癌细胞系中的作用,证明ADAM12可以调控肺癌细胞对dasatinb的敏感性。SLAP蛋白的过表达可以负调控ADAM12蛋白的表达,并且下调p-C-SRC的表达,增加了肺癌细胞的凋亡,抑制了细胞的增殖。通过敲减SLAP将过表达SLAP的肺癌细胞系中SLAP蛋白水平回复到正常水平后,逆转了SLAP蛋白在上诉细胞系的作用,证明SLAP可以负调控ADAM12和p-C-SRC的表达来调控肺癌细胞系的生物学功能。在过表达SLAP肺癌细胞系进行2Gyx4放疗前通过转染过表达的C-SRC和AKT蛋白使p-C-SRC和p-AKT蛋白水平升高,观察到SLAP过表达细胞系中获得的放疗敏感性和低水平的增殖,迁移,侵袭能力都发生了逆转。在低表达SLAP肺癌细胞系进行2Gyx4放疗前通过敲减的C-SRC和AKT蛋白使p-C-SRC和p-AKT蛋白水平降低,在SLAP低表达细胞系中获得的放疗抵抗和高水平的增殖,迁移,侵袭能力都发生了逆转。证明SLAP可以负调控CSRC蛋白的磷酸化,从而降低肿瘤细胞的增殖能力,侵袭能力和迁徙能力。另一方面SLAP可以通过负调控ADAM12蛋白逆转放疗产生的放疗抵抗和化疗抵抗,为临床上化疗放疗联合治疗提供新的思路。
【图文】：

细胞系,分别测定,细胞板,单次

13图 1. A549,H1650,H460 细胞系进行 0Gy, 2Gy, 4Gy, 后 48h, C-SRC, P-C-SRC 的蛋白表达情况。3.2 C-SRC 抑制剂 dasatinib 可以有效抑制单次 2Gy 放疗后 P-C-SRC 的表达，，但对 2Gy将消化下来的 A549，H1650, H460 细胞系细胞板中，分别作为对照组，dasatinib 组，放疗 2Gy 和dasatinib 组，于处理 48 小时后检测 C-SRC,P-SRC 的A549, H1650, H460 细胞系在经过 2Gy 和 2Gyx4 的

细胞系,分别测定,过表达,蛋白

H1650, H460 细胞系在经过 2Gy 和 2Gyx4ADAM12 蛋白的表达情况。3.4 ADAM12 蛋白参与了 2Gyx4 放疗后肺癌生使用慢病毒载体分别构建过表达和敲减 ADAM胞系如图 4A 所示 A549, H1650, H460 细胞系在ADAM12 蛋白后分别测定各个细胞系中 ADAM12细胞系在敲除 ADAM12 基因和过表达 ADAM12
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R734.2;R730.55

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