基于细菌趋化性的细菌印迹技术研究

发布时间：2020-06-03 23:54

【摘要】：开发精准的细菌定量检测分析技术在食品卫生、环境卫生、实验诊断等领域具有重要的实用价值,而靶细菌的高选择性分离是细菌定量检测技术取得成功的前提条件与关键步骤。众所周知,传统方法优缺并存无法满足分子生物学对细菌分离越来越精细的要求,因此开发新的高选择性分离靶细菌的分离技术对细菌定量检测具有重要意义。作为分离细菌的新技术,细菌印迹技术是一门以靶细菌为模板通过功能单体和交联剂来合成与靶细菌具有互补结构的孔穴的新技术。这种孔穴结构能够通过形状、大小的匹配和化学键作用与靶细菌特异性结合。但是,传统细菌印迹技术分离细菌的方法均只把细菌看做为BIPs(Bacterial imprinted polymers,BIPs)的模板分子,而忽视了细菌作为微生物所存在的生物学特性,因此分离效果不理想。本论文的研究思路是把细菌趋化性和细菌印迹选择性相结合,开发一种分离细菌的新方法。本研究在保证传统细菌印迹材料识别能力的基础上,利用细菌趋化性产生的主动识别对BIPs的吸附选择性进行二次增强。为了确保细菌印迹材料传统的识别能力,本文通过表面压印的方式制备特异性识别靶细菌的BIPs。为了实现细菌的趋化性,微通道结构将被引入到BIPs材料中。该微通道结构将被应用于引诱剂和驱避剂的释放。在细菌吸附过程中,靶细菌趋化剂和非靶细菌驱避剂的释放可避免非靶细菌的干扰而促使靶细菌产生选择性移动和识别以实现靶细菌的高选择性分离。目的:将传统的细菌印迹技术的被动识别与细菌趋化性诱导的主动识别相结合开发出比传统细菌印迹材料具有更高的靶向识别选择性、可用于混合细菌溶液中靶细菌的分离方法。方法:通过表面压印技术制备细菌PDMS印迹膜,并用甲基三氯硅烷修饰印迹膜,最后用微针(36孔)在清洗干净的PDMS印迹膜上致孔得到具有微通道的PDMS印迹膜。用PDMS印迹膜的印迹侧朝向细菌液,非印迹侧则朝向趋化剂溶液制备出可以缓慢释放趋化剂的装置来研究单一菌液和混合菌液中PDMS印迹膜的吸附效果和选择性。结果:本论文通过表面印迹技术制备了可选择性识别细菌的PDMS印迹膜;并通过微针致孔方法得到可以引入趋化剂和趋避剂的微通道PDMS印迹膜。在单一溶液中,靶细菌趋化剂可明显增加靶细菌的吸附量,而干扰菌趋避剂也可明显降低干扰菌的吸附量;在混合菌液中,同时增加或者减弱靶细菌、干扰菌吸附的趋避剂或趋避剂对靶细菌MIP的选择性几乎不产生影响,而只对靶细菌或者干扰菌任意一种产生趋化或趋避作用的趋化剂或趋避剂能增加靶细菌MIP对靶细菌的选择性,从而实现靶细菌的选择性分离。结论:基于细菌趋化剂和微通道印迹膜分离细菌的方法可同时实现细菌的被动和主动识别,从而提高PDMS印迹膜的选择性以实现细菌的高选择性分离。本研究为解决细菌印迹技术中印迹孔穴选择性不高提出了新思路,推动了细菌印迹技术在临床、环境细菌检测中的发展。
【图文】：

过程图,印迹,过程,预聚体

1) 取 1 mL 清洗三遍的大肠杆菌菌（或金黄色葡萄球菌）悬浮液（107CFU/mL）滴加在灭菌的显微镜载玻片上，在 4 ℃下静置 2 小时使细菌沉降后，剩余的溶剂在无菌通风环境下除去。将聚二甲基硅氧烷(PDMS) 预聚体、固化剂采用环己烷溶解（体积比=2:1）并涂于玻璃片。预聚体在 80 ℃固化 4 min，将涂有细菌的载玻片压入上述未完全固化的 PDMS 表面并在 37 ℃下保持 7 h 后再将 PDMS 在 80 ℃继续固化 1 h。最后剥离模板菌上的载玻片，取出印迹膜，并等面积分成圆形小片，用超声清洗机洗涤去除模板细菌。最后将 PDMS 膜和甲基三氯硅烷放在密闭容器中，置于干燥箱 60℃烘干后，，三蒸水超声清洗 1 min取出。用微针（36 孔）在清洗干净的 PDMS 印迹膜上打孔，每片膜 180 个孔。（NIP 不加模板菌，其他过程同 MIP）2) 将合成的 PDMS 印迹膜和非印迹 PDMS 膜洗净放入显微镜和扫描电镜下观察，比较 MIP 和 NIP 的差别。金黄色葡萄球菌 MIP 合成方法与上述步骤相同。

示意图,筛选装置,细菌,培养皿

图 2. 细菌趋化剂筛选装置示意图。.2.3.2 模板菌浓度的优化1) 分别以浓度为 103、 104、105、 106、107、108CFU/mL 的大肠杆菌为模合成 PDMS 膜备用。2) 取相同面积的 PDMS 膜（MIP 和 NIP 各 3 片）粘在培养皿上，紫外灯照 1 h 后将 3 mL 悬浮好的大肠杆菌菌（浓度 106CFU/mL）加入培养皿, 37.5 ℃养 2 h。3) 2 h 后取出 PDMS 膜，PBS 液冲洗 PDMS 膜将表面的细菌冲洗干净，然后入新的培养皿，加入 1 mL 吹打一分钟。4) 取洗涤液稀释 100 倍后，取 100μL 涂 LB 平板。放入 37.5 ℃培养箱培养夜后计数 LB 平板的菌落数。比较不同浓度模板菌合成的 PDMS 膜的吸吸附效。
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R446.5

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