分子印迹聚合物的制备及其在生物体液中酪氨酸和甘氨酸的代谢产物分析中的应用研究

发布时间：2020-06-04 14:23

【摘要】：氨基酸在生命体中是不可或缺的一类物质,一些非必需氨基酸及其代谢物与人类某些疾病有一定的关联性。酪氨酸与甘氨酸是人体中重要的非必需氨基酸,这两种非必需氨基酸的代谢异常与某些疾病有一定的联系。研究发现肝肾疾病、恶性肿瘤等疾病发生时,酪氨酸、甘氨酸的代谢会出现异常。因此,研究建立简便、灵敏、快速的分析方法并运用到人体体液中酪氨酸、甘氨酸的代谢物分离与分析检测,对某些疾病的辅助诊断、治疗与监测有着重要的现实意义。本文研究制备了相关的分子印迹聚合物,并用于人体体液中酪氨酸、甘氨酸的代谢物的分离富集,结合超高效液相色谱分析技术,构建了人体体液中酪氨酸、甘氨酸的代谢物分析新方法,并用于实际尿样检测,取得了满意的效果。其主要研究成果如下:1.以对羟苯基乙酸为模板分子,1-乙烯基咪唑为功能单体,三甲基丙烷三丙烯酸酯为交联剂,N-N偶氮二异丁腈为引发剂,乙腈为溶剂,采用沉淀聚合的方法,制备了对羟苯基乙酸分子印迹聚合物(PHPAA-MIP)。根据吸附动力学实验探究了PHPAA-MIP吸附机理,评估了PHPAA-MIP的识别性能及其选择性能。结果表明,PHPAA-MIP对尿样中的对羟苯基乳酸、对羟苯基乙酸以及对羟苯基丙酸有较高的选择吸附性能。2.建立了基于分子印迹聚合物分离富集-超高效液相色谱法测定人体尿液中的对羟苯基乳酸、对羟苯基乙酸和对羟苯基丙酸的分析新方法。尿样稀释一倍,经ENVI-C18柱除无机盐,用PHPAA-MIP萃取目标分析物,最终的解吸液用UHPLC-FLD检测。在优化的萃取/解吸条件下,采用ZORBAX SB-C18快速分离柱,以50 mmol/L乙酸-乙酸铵(pH=5.3):乙腈=95:5(V/V)为流动相,流速为0.2 mL/min下分离,荧光检测波长为λex=277 nm、λem=316 nm。三种分析物的检测限和定量限分别为8.5×10~(-3)-2.8×10~(-2) mg/L与2.8×10~(-2)-9.3×10~(-2) mg/L,加标回收率为75.7%-110.3%,相对标准偏差小于15%。该方选择性好,可用于尿液中三种酪氨酸的代谢产物的同时测定。3.以N-苯基甘氨酸为模板分子,丙烯酰胺为功能单体,三甲基丙烷三丙烯酸酯为交联剂,N-N偶氮二异丁腈为引发剂,乙腈为溶剂,采用沉淀聚合法制备了分子印迹聚合物(NPG-MIP)。采用各种分析技术对所制备的聚合物进行了表征,并研究了该分子印迹聚合物的吸附特性。结果表明,NPG-MIP对目标分析物的吸附比NIP具有更好的亲和性,对目标分析物的结构类似物选择性差,印迹因子IF=4.7。该材料为从复杂样品中(尿样)分离NPG奠定了基础。4.建立了基于分子印迹聚合物分离富集-超高效液相色谱法测定人体尿样中N-苯基甘氨酸的分析新方法。尿样稀释20倍后,采用NPG-MIP印迹聚合物对尿样进行前处理,UHPLC-DAD检测其解吸液。在优化萃取/解吸条件下,采用ZORBAX SB-C18快速分离柱,以20 mmol/L磷酸二氢钠(pH=5.6):甲醇=90:10(V/V)为流动相,流速为0.2 mL/min下分离,紫外检测波长为λ=239 nm。NPG的线性范围在0.5-100 mg/L,检测限与定量限分别为1.6×10~(-2) mg/L和5.5×10~(-2)mg/L,该方法的加标回收率高于84.7%,相对标准偏差小于11%。该方法对目标分析物具有较高的选择性,为进一步探究甘氨酸的代谢与癌症之间的关联性提供了方法学基础。
【图文】：

甘氨酸,酪氨酸,代谢产物,分子结构式

是酪氨酸的重要代谢产物；N-苯基甘氨酸（N-phenylglycine, NPG）、N-巴豆酰基甘氨酸(N-Tigloylglycine, NTG)等是甘氨酸的代谢产物。它们的分子结构见图 1.1。图1.1 酪氨酸、甘氨酸及其代谢产物的分子结构式Fig.1.1 Molecular structure of glycine, tyrosine and its metabolites1.1.2 样品前处理技术酪氨酸、甘氨酸及其代谢产物多存在血液、脑脊液、尿液等相关体液中。由于体液中的成分比较复杂，内源性物质多，，对目标物的分离及准确测量干扰大。又由于人体组织中酪氨酸、甘氨酸及其代谢产物的浓度本身较低，这就更加增大了目标分析物的检测难度，同时，基质效应可能会造成某些物质无法检测。因此，样品前处理是非常重要的环节。目前，生物样本分析的样品前处理技术主要包括稀释法、沉淀法、液-液萃取法、固相萃取法等。1. 直接稀释法稀释法是指使用合适稀释剂将样本稀释一定程度，从而起到降低基质效应的作用。王小燕[23]等使用稀释法测定人体体液中多种重金属元素，测量结果重现性好，其加标回收率在 90％-120％之间。此分析方法虽简便、回收率高、成本低

过程图,对羟苯基,分子印迹聚合物,乙酸

第二章对羟苯基乙酸分子印迹聚合物的制备及其吸附性能研究剂，对羟苯基乙酸（0.3198g, 2.1mmol）为模板分子，1-乙烯基咪唑（760 μL,8.4mmol）为功能单体并置于 250 mL 圆底烧瓶中，搅拌 2 min。然后加入三甲基丙烷三丙烯酸酯（1275 μL, 4 mmol），超声 5min。再加入引发剂 N-N 偶氮二异丁腈（0.0341 g, 0.2 mmol），通入氮气 15 min后密封烧瓶，置于 60°C 水浴中反应12 h。聚合完成后，混合溶液以 5000 rpm 离心 15 min，丢弃上清液，将固体产物置于索氏提取仪中用甲醇：乙酸=9:1（v/v）溶液进行洗涤，3-4 天替换一次洗脱溶剂，直至检测液中无对羟苯基乙酸为止。最后将溶剂换为甲醇洗去聚合物上残余乙酸。所制备的 PHPAA-MIP 在 60℃环境中干燥 24 h，保存备用。其制备流程如图 2.1 所示。同时制备空白聚合物 NIP 作为对照，其制备方法同上，但不加模板分子。
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：O631.3;O657.72;R446.1

【相似文献】