基于纳米酶的无标记化学发光成像多组分免疫分析新方法

发布时间：2020-06-05 19:12

【摘要】：鉴于人体免疫系统的复杂性和动态性,当前癌症早期筛查和临床疾病诊断需要同时检测多种疾病标志物。基于抗体阵列的多组分化学发光免疫分析技术由于能够实现高灵敏度、高通量、宽线性范围、实时、原位及在体的检测,日益受到人们的青睐。然而,当前化学发光多组分免疫分析法存在需要标记、分离及多次洗涤步骤,操作繁琐,试剂消耗量大,耗时等问题。无标记免疫分析无需预先标记,也无需分离步骤,有效地避免了抗原或抗体因标记、分离及多次洗涤过程而导致活性降低等问题,具有试剂消耗量少,分析速度快,操作简便等优势。相较于化学发光分析体系中常用的天然酶,有着过氧化物酶活性的纳米材料具有优良的催化活性,制备简便,性质稳定,可调控性等优势。因此本论文提出了基于多种新型纳米酶传感阵列的无标记化学发光成像多组分免疫分析(CLI-MIA)新策略和新方法。基于纳米酶传感阵列的CLI-MIA策略集成了纳米酶的低成本、稳定性和可调控性,化学发光测定的高灵敏度,免疫分析的高特异性以及抗体阵列基于的电感耦合CCD成像高检测通量等优势。本论文合成了金属氢氧化物纳米笼、中空双金属纳米球、多孔双金属核壳纳米材料和金属有机框架衍生物纳米八面体材料,探究其过氧化物酶活性,并应用于构建无标记化学发光成像多组分免疫传感器阵列,实现了无标记、高通量、高灵敏、低消耗、可靠和快速的多肿瘤标志物检测。具体研究工作如下:(1)本研究提出了基于3D Cu(OH)_2超笼纳米酶的无标记化学发光成像多组分免疫分析新策略,旨在实现同时检测多肿瘤标志物。通过低能耗的绿色合成程序,由1DCu(OH)_2纳米带自组装形成的3D Cu(OH)_2超笼具有优良的过氧化物酶活性。将分散在壳聚糖中的3D Cu(OH)_2超笼捕获到环氧官能化微孔阵列中制成纳米酶传感界面。生物功能化复合物具有较大的反应表面积和优异的生物相容性,因此基于链霉亲和素对生物素化抗体的高度选择性识别,从而使得多种抗体能够被有效地固定在纳米酶传感阵列中。与相应的抗原在线温育后,形成的免疫复合物会阻碍化学发光底物向3D Cu(OH)_2超笼纳米酶传感界面的扩散通道,最终导致CLI信号的降低。通过收集阵列中的每个传感微孔的CLI信号,从而实现多组分定量检测。以AFP,CEA,CA125为模型联合标志物组,CLI免疫传感阵列检测的线性范围分别为 0.0010-100 ng/mL(AFP),0.0010-75 ng/mL(CEA),0.0010-200 U/mL(CA125),检测限低至 0.16pg/mL(AFP),0.20pg/mL(CEA),1.7×10~(-4)U/mL(CA 125)。本工作提出的基于3D Cu(OH)_2超笼纳米酶的无标记CLI-MIA新策略,具有高通量、超灵敏、低消耗等优势,为癌症大规模癌症筛查与联合准确诊断提供了新思路和新平台。(2)本研究提出一种基于多孔PtAg双金属纳米酶的化学发光成像多组分免疫分析新方法,用于在无标记的模式下同时检测多种肿瘤标志物,具有优良的灵敏度、超高的检测通量及可接受的稳定性。本工作制备的PtAg纳米颗粒(PtAgNPs)为多孔核壳纳米八面体结构,具有本征的过氧化物酶以及氧化酶双功能酶活性,并且能够维持长时间的催化活性。这种无标记多元测定可以通过简单的策略轻松实现。首先将多孔PtAgNPs包埋于环氧硅烷化传感阵列的微孔中制成纳米酶传感界面。然后用链霉亲和素功能化PtAgNPs捕获多组分生物素化抗体。当温育上相对应的抗原后,所形成的免疫复合物会阻碍多孔PtAgNPs纳米酶对化学发光底物的催化反应。通过电感耦合CCD照相机积分收集阵列中不同区域的化学发光亮度,从而实现了同时检测CA 125,CEA和AFP。基于多孔PtAg双金属纳米酶的无标记 CLI-MIA 方法在 0.0010-80 U/mL(CA 125)、0.0010-75 ng/mL(CEA)和0.0010-80ng/mL(AFP)的浓度范围内显示出良好的线性,检测限为1.3×10~(-4)U/mL(CA 125)、0.10 pg/mL(CEA)和0.13 pg/mL(AFP)。无标记CLI-MIA阵列具备良好的实际样品的检测能力,并表现出优异的稳定性和特异性。(3)本研究提出了一种基于中空PdNi纳米球(PdNi hNPs)的无标记化学发光发光成像多组分免疫分析(CLI-MIA)新方法,实现了对乳腺癌的联合肿瘤标志物组的同时检测。PdNi hNPs具有氧化酶和过氧化物酶的双酶活性。利用PdNi hNPs的优良过氧化物酶活性,将PdNi hNPs包埋于环氧基硅烷化微孔阵列中制成纳米酶传感阵列。然后通过链霉亲和素-生物素系统固定多种生物素化抗体,利用牛血清蛋白封闭未反应活性位点后,在相应位点温育上多种抗原。抗原-抗体复合物会阻碍PdNi hNPs纳米酶对化学发光底物的催化作用,导致化学发光信号值下降。通过电感耦合CCD照相机积分收集不同区域的发光亮度,实现了对多肿瘤标志物的无标记、高通量、快速的检测。从微孔区域积分收集的化学发光成像亮度值与肿瘤标志物浓度的对数值作图,可得到对多种标志物检测的工作曲线。基于 PdNi hNPs 纳米酶传感阵列的 CLI-MIA 策略在 0.0050-75 ng/mL,0.0010-100 U/mL和0.0010-240 U/mL范围内实现了对CEA,CA 125,CA 15-3同时检测,并能成功应用于实际样品检测。本工作提出的无标记CLI-MIA可简便地用于癌症早期筛查与临床诊断,具备很好的临床应用潜力。(4)本研究以Cu-BTC为前驱体合成了 Cu/CuO/Cu_2O纳米八面体金属有机框架材料(MOFs)衍生物,首次探究发现其具有优异的过氧化物酶活性,并应用于构建化学发光成像多组分免疫分析新方法,实现对多肿瘤标志物的无标记、超灵敏、高通量检测。基于纳米酶的无标记多元测定可通过简单的制作过程实现。首先,将壳聚糖分散的Cu/CuO/Cu_2O纳米酶包埋于环氧基硅烷化微孔阵列中制成纳米酶传感阵列。然后通过链霉亲和素将多种生物素化抗体专一性固定于微孔传感阵列。当温育相对应的抗原后,形成的抗体-抗原复合物会阻碍化学发光底物向Cu/CuO/Cu20纳米酶传感界面的扩散通道,最终导致CLI信号的减少。通过收集阵列中每个感应微孔的发光亮度,从而实现高通量、超灵敏、低消耗的多种疾病标志物的同时检测。以CEA,CA 125,CA 19-9为模型联合标志物组,该化学发光成像免疫传感阵列的检测线性范围分别为0.0010-75 ng/mL(CEA)、0.0010-500 U/mL(CA 125)和 0.0010-240 U/mL(CA 19-9),检测限低至 0.25 pg/mL(CEA)、2.0×10~(-4)U/mL(CA 125)和1.4×10~(-4) U/mL(CA 19-9)。该基于MOFs衍生物纳米酶的无标记免疫传感阵列可靠,灵敏,简便,通量高,为发展多元生物传感分析提供了新思路和新平台。
【图文】：

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本文编号：2698484