伤寒孙门菌反义RNA AsfD分子特性及功能研究

发布时间：2020-06-07 04:42

【摘要】：目的:细菌的非编码RNA(non-coding RNA,ncRNA)能够调控细菌的许多行为,如动力、生物膜形成和毒力等。本研究前期通过对伤寒沙门菌(S.Typhi)进行高通量测序转录组分析,发现了许多非编码RNA,其中在flhDC操纵子对侧编码的反义RNA引起了我们的注意,并将其命名为AsfD。本文旨在对AsfD进行分子鉴定,并对其表达特性和功能开展深入研究。方法:1.AsfD的分子特征鉴定:在AsfD已知序列区设计两条特异性探针引物,通过RT-PCR和Northern杂交验证AsfD在S.Typhi中的存在;然后运用5’RACE和RT-PCR检测AsfD的5’端和3’端,结合Northern杂交结果分析AsfD分子全长。2.AsfD表达特性分析:用Northern杂交和qRT-PCR检测伤寒沙门菌不同生长时期AsfD的表达;通过qRT-PCR分析伤寒沙门菌在不同应激条件下(酸、氧、高渗)AsfD的表达特性。3.AsfD高表达菌株制备:根据Northern杂交,5’RACE和RT-PCR实验的鉴定结果,设计AsfD特异性引物,通过PCR扩增AsfD目的片段。扩增的片段包括了Nco I和EcoR I酶切位点,并克隆到载体pBAD/HisA上。构建相应的高表达菌株(WT+pBAD-asfD)和对照株(WT+pBAD)。4.细菌动力实验:将S.Typhi的AsfD高表达菌株及空质粒对照株接种于半固体培养基,过夜培养,测S.Typhi在平板上的动力圈直径。5.细菌生物膜分析实验:在TSB培养基中培养AsfD高表达菌株及对照株至OD_(600)为0.4,并将菌液接种至96孔板中培养。96 h后用结晶紫染液对生物膜进行染色,洗脱后检测570 nm波长处吸光度值,分析生物膜形成量。6.细菌对HeLa细胞侵袭实验:将AsfD高表达菌株和空质粒对照株培养至对数早期,然后加入培养有HeLa细胞的24孔板中与He La细胞共孵育,比较两个菌株对于He La细胞侵袭能力的差异。7.qRT-PCR检测靶基因flhDC及鞭毛基因mRNA:AsfD高表达菌株和空质粒对照株培养至对数早期,在0.2%(w/v)阿拉伯糖诱导培养30 min。通过TRIzol法提取RNA,用qRT-PCR分析AsfD对flhDC、fli A和fljB的表达水平影响。8.Western blot分析鞭毛蛋白FljB:将伤寒沙门菌AsfD高表达菌株和空质粒对照株培养至对数早期,在0.2%(w/v)阿拉伯糖诱导培养0、15、30和60 min。超声破碎,离心取上清,使用蛋白质印迹法检测AsfD高表达菌株和空质粒对照株表达差异。结果:1.Northern杂交结果显示,伤寒沙门菌中AsfD长约2300 nt;RACE实验表明AsfD 5’端位于flhC基因终止密码子下游590 bp处;RT-PCR结果表明AsfD 3’端位于flhD基因起始密码子上游558 bp~788 bp之间。2.Northern杂交和qRT-PCR结果显示,AsfD的表达水平随着伤寒沙门菌的生长而增高,并且在稳态期达到最高水平;AsfD在酸、氧、高渗应激后表达均明显下降。3.成功构建AsfD高表达菌株(WT+pBAD-asf D)和空质粒对照株(WT+pBAD)。4.动力实验显示,与空质粒对照株相比,AsfD高表达菌株动力明显增强。5.生物膜实验显示,与对照株相比,AsfD高表达菌株生物膜形成能力增强。6.上皮细胞侵袭实验结果显示,AsfD高表达菌株和对照株对He La细胞的侵袭能力无明显变化。7.qRT-PCR结果显示,与空质粒对照株相比,AsfD高表达菌株能够上调flhDC、fliA和fljB mRNA的表达。8.Western blot结果显示,与空质粒对照株相比,AsfD高表达菌株能够上调鞭毛蛋白FljB的表达。结论:在S.Typhi中新鉴定了一个长链反义RNA AsfD,其分子全长在2079 nt~2310nt之间,AsfD确定的2079 nt序列能够完全覆盖flhDC操纵子;AsfD能增强伤寒沙门菌生物膜形成,并能通过直接上调靶基因flhDC的表达,从而增强伤寒沙门菌动力。
【图文】：

20图3.1 5'RACE原理图Fig 3.1 5' RACE schematic3.2.2.2.3 5’ RACE实验（1） 提取伤寒沙门菌总RNA，，方法同前。（2）第一条cDNA链合成步骤 1 如下：组份 体积5X First-Strand Buffer 4.0 μlDTT (100 mM) 0.5 μldNTPs (20 mM） 1.0 μl总体积 5.5 μl

图 4.2 检测探针质量Fig 4.2 The quality of pro 6000 Marker；1：RNA 样本与特图4.3 Northern印迹法检测Fig 4.3 Detection of AsfD by No
【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R446.5

【参考文献】

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1 Ahmed Tawfik;Paul K Flanagan;Barry J Campbell;;Escherichia coli-host macrophage interactions in the pathogenesis of inflammatory bowel disease[J];World Journal of Gastroenterology;2014年27期

本文编号：2700862