基于全基因组重测序的肠炎沙门菌耐药性研究

发布时间：2020-06-08 04:58

【摘要】：在世界范围内,由肠炎沙门菌(Salmonella enterica serovor Entteritidis,S.Enteritidis)导致的沙门菌病是一种重要的食源性传染病。肠炎沙门菌能够导致禽类的发病及死亡,在感染种鸡后,常表现为隐性带菌而不发病,该菌能够感染人类和其他多种动物,是一种重要且危害严重的人兽共患病原菌。抗菌药物的使用是防治肠炎沙门菌感染的重要手段之一,而肠炎沙门菌耐药性的产生和传播则极大地制约了抗菌药物的使用效果。耐药基因的产生和传播是肠炎沙门菌耐药性的重要分子机制之一,高通量测序技术的发展和突破为研究耐药性的分子机制提供了极大的便利。本研究通过对190株肠炎沙门菌的全基因组重测序研究,探讨高通量测序技术在肠炎沙门菌耐药性研究中的应用,分析我国肠炎沙门菌的分子耐药机制和演化规律。一、肠炎沙门菌的生物辨识利用生物信息学技术对190株分离菌株的全基因组测序raw reads进行质量控制与拼接,得到组装长序列,将最终assembly文件作为全基因组数据材料进行后续分析。首先使用MicrobeTrakr在线工具鉴定种属,190株测序菌株均为沙门菌属。然后使用sistr_cmd软件鉴定测序菌株血清型,均为肠炎沙门菌。最后使用PubMLST工具鉴定其ST型,除SAL0000131和SAL0000132两株为新型以外,其余均为ST11,符合肠炎沙门菌的ST型特征,而SAL0000131和SAL0000132的aroC基因的突变是导致该两株菌株表现为新ST型的原因。二、肠炎沙门菌的耐药基因与耐药性对190株肠炎沙门菌进行耐药表型测定,肠炎沙门菌对NAL的耐药率最高,为83.7%,对 AMP 和 AMC 的耐药性分别达到 62.6%和 62.1%,对 CFZ(41.6%)、STR(45.8%)、SXT(29.5%)和TET(21.6%)的耐药菌株也较多,其他药物的耐药菌株数量较少,AMK甚至没有任何菌株表现为耐药。在不同宿主中,43株人源肠炎沙门菌不仅有非常宽的耐药谱,其耐药水平也相当高,整体耐药情况最复杂,多重耐药率达到65.1%,且多重耐药菌株的耐药谱非常宽,其中NAL耐药率最高,达到81.4%;对AMP、AMC和CFZ的耐药率均超过50%,分别达到62.8%、65.1%和53.5%;对ATM和STR的耐药率较高,分别达到23.3%和 37.2%;对 KAN、GEN、TET、SXT、CHL 和 OLA 的耐药率较低,分别达到 16.3%、16.3%、16.3%、11.6%、11.6%和 9.3%;CIP 和 ENR 的耐药率仅有 2.3%和 4.7%;对 MEM、AMK和NIT无耐药菌株。鸡源肠炎沙门菌耐药谱较宽,耐药率较高,耐药水平较高,整体耐药情况较为复杂,其中NAL耐药率最高,为94.3%,MIC50达到512μg/ml;其次为AMP、AMC、CFZ 和 STR,耐药率分别达到 69.9%、68.3%、42.3%和 52.0%;SXT 和 TET的耐药率较高,分别为31.7%和25.6%;其余药物的耐药率则较低,均不超过10%;AMK没有任何耐药菌株。其余宿主肠炎沙门菌数量较少,其耐药率远低于人源与鸡源肠炎沙门菌。使用blast软件将组装序列与ResFinder数据库比对,共检测到50种耐药相关基因,分别为 aadA1、aadA2、aadA5、aadA16、aadA22、aac(6')Ib-cr、aac(3)-Iva、aac(3)-IId、aph(3')-IIa、aph(3)-Ia、aph(3')-Ic、aph(4)-la、aph(3)-Iva、arr-3、blaTEM-1、blaCTx-M-3、blacrx-M-14、blaCTX-M-55、blacTX-M-65、blaoXA-1、blaNDM-5、blaMIR-2、blaMIR-6、blacMY-2、catA1、catB、catB3、cmlA1、dfrA1、dfrA12、dfrA14、dfrA17、dfrA27、ermB、fosA、floR、lnuF、mefB、mphA、oqxA、oqxB、qnrA7、strA、sul2、sul1、sul3、tetA、tetB和tetC。去除相似度低于80%和覆盖度低于70%的基因,得到与表型试验相关的耐药基因共计35种,分别为β-内酰胺类耐药相关基因 7 种(bfaTEM-1、blaCTX-M-3、blaCTX-M-14、blaCTX-M-55、blaCTX-M-65、blaoXA-1和blaCMY-2),氨基糖苷类耐药相关基因13种(strA、strB、aadA1、aadA4、aadAB、aadA16、aadA22、aac(3)-IId、aph(3')-Ila、aph(3')-Ia、aph(4)-Ia、aph(3)-Iva和aac(6')Ib-cr),喹诺酮类耐药相关基因3种(qnrA7、oqxA、oq万),四环素类耐药相关基因2种(tetA和tetC),磺胺类耐药相关基因3种(sul1、sul2和sul3),三甲氧苄二氨嘧啶类相关耐药基因3种(dfrA1、dfrA17和dfrA27)以及酰胺醇类耐药相关基因4种(catB3、catB、floR和cmLA1)。基因型与表型对应关系良好,blaTEM-1基因与青霉素类药物AMP和AMC的对应率达到96.1%和95.1%,strA基因和strB基因与氨基糖苷类药物STR的对应率达到90.9%,tetA基因与四环素类药物四环素对应率达到82.9%,dfrA17基因与磺胺类药物复方新诺明的对应率达到88.9%,catB3、catB、floR和cmlA1与酰胺醇类药物CHL对应性达到了 100%,均表现出优良的对应性,但仍然存在表型与基因型不对应的情况,说明仍然有未知的耐药机制在发挥作用。基因的点突变研究显示,基因点突变确实能够影响耐药表型。blarEM-1基因的A120C突变在6株肠炎沙门菌中被检测到,该6株菌株中的5株表现出头孢唑林的高耐药表型(MIC≥512μg/ml)。strA中检测到2种非共有点突变(C295T和G445C),未发现其对表型存在显著影响。strB检测到11种非共有点突变(A139G、T332C、T334C、T343G、T345C、C358G、T361C、G364C、T535G、G592T 和 G574T),其中 T332C、T334C、T343G、T345C、C358G、T361C和G364C在基因序列上的位置相当接近。tetA基因中共检测到10中非共有点突变,其中发生A124G突变的YZU0232和YZU0266的四环素耐药表型均为不耐药,该突变可能对tetA基因功能有减弱作用,发生G250A(SAL0000212和YZU0228)和G277A(YZU0254)的菌株表现出的MIC水平达到耐药突破点的8倍,该两种点突变可能对耐药性有提高作用。喹诺酮类药物的耐药性产生与QRDR的点突变具有关联,并且由于各基因之间、各点突变之间的相互配合导致不同的耐药表型和水平。在质粒检测分析中发现IncX1型质粒携带有众多耐药基因,可能与肠炎沙门菌的耐药流行有密切关联。对不同质粒所携带的耐药基因进行检测,我们发现95个IncX1型质粒携带了 77个strA基因中的76个、77个strB基因中的76个、77个sul2基因中的76个、35个tetA基因中的31个和103个blaTEM-1基因中的95个,IncX1型质粒主要携带的基因为str4、strB、sul2、tetA和blaTEM-1,与氨基糖苷类、磺胺类、四环素类和β-内酰胺类抗生素的耐药性相关,而其余质粒均不携带耐药基因,显示IncX1型是肠炎沙门菌耐药基因流行的关键性可移动元件。三、肠炎沙门菌的进化与耐药性研究使用Parsnp软件对190株肠炎沙门菌作核心基因组进化树,并与背景信息对应分析。MIC表型、耐药基因型和质粒分型在进化关系上呈现出明显的谱系差异,核心基因组进化树的构建所产生的不同分支能够与耐药相关背景信息较为准确清晰的对应。使用Parsnp软件对国内外共计208株肠炎沙门菌进行核心基因组进化树构建,结果显示国内菌株与美国、加拿大、韩国、莫斯科、丹麦和巴西的菌株在进化树上可以明显区分,国外菌株处于独立分支且能够按照宿主和年代来源形成较为明确的谱系。国内肠炎沙门菌的流行则由两部分组成,其一为国内流行的肠炎沙门菌,其二可能是来自于美国和加拿大等北美国家的肠炎沙门菌。根据国内外菌株的进化关系对比分析,国内肠炎沙门菌的进化结构比国外菌株更为复杂,国内各宿主、地区的肠炎沙门菌在进化关系上非常接近,而非国外菌株所表现出的不同谱系,可能意味着国内肠炎沙门菌的流行范围更大,宿主间的菌株交流更频繁。基于全基因组重测序的进化分析在一定程度上能够对肠炎沙门菌耐药性作出预测和指导。
【图文】：

示意图,文库构建,示意图,测序反应

序深度逦图１文库构建示意图逡逑，对后逦Ｆｉｇｕｒｅ邋１邋Ｌｉｂｒａｒｙ邋Ｐ—ａｒａｔｉｏｎ逡逑读长以１５0ｂｐ或２５０ｂｐ为常用。逡逑示。测序反应在邋ｆｌｏｗ邋Ｃｅｌｌ邋中进行，ｆｌｏｗ邋Ｃｅｌｌ逡逑碎后的短序列片段。短片段通过ｆｌｏｗ邋ｃｅｌｌ逡逑合在ｆｌｏｗ邋ｃｅｌｌ中的ｌａｎｅ上。每个ｆｌｏｗ邋ｃｅｌｌ逡逑ｎｅ，能够同时■并彳亍的进彳亍测序反应。使用逡逑酶进行ＰＣＲ反应，待测片段经过重复扩增，逡逑片段，通过变性操作使双链片段解链成为逡逑且再锚定到固相表面的其他区域，根据需逡逑数，于是在ｆｌｏｗ邋Ｃｅｌｌ中得到大量双链待测逡逑ａｎｅ的总表面积。逡逑

示意图,示意图,信息学,测序

逦基于全基因组重测序的（Ａ）文库的构建（Ｌｉｂｒａｒｙ邋Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）逡逑如图１所示。将基因组打断成为短序列片在片段的两头连接上特定的接头（Ａｄａｐｔｏｒ），人工设计的碱基序列，发挥锚定功能。若为转录则需要首先对序列进行反转工作。片段的大ｓｉｚｅ）将会直接影响后续的信息学分析，故而组测序，首先要确定片段化的大小，从而使得段组装（Ａｓｓｅｍｂｌｙ）工作更加准确。在固定的下，过长的测序读长会导致测序序列的质量下续组装和信息学工作带来困难，，因此目前的测（Ｂ）簇扩增（ＣｌｕｓｔｅｒＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）逡逑Ｃｌｕｓｔｅｒ邋Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ逦如图邋２邋功能为结合
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R446.5

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