整合素αvβ3拮抗剂西仑吉肽干预放射性肺纤维化的作用和机制研究

发布时间：2020-06-09 10:19

【摘要】：第一部分 整合素αvβ3拮抗剂西仑吉肽干预放射性肺纤维化的动物水平研究目的:放射性肺纤维化(RIPF)是放射治疗的常见并发症,并无有效治疗手段。转化生长因子β1(TGFβ1)是被公认与放射性肺纤维化发生关系最为密切的细胞因子,文献报道整合素αvβ3拮抗剂西仑吉肽能抑制TGFβ1的活化干预肠纤维化的发生。然而西仑吉肽对放射性肺纤维化的作用目前无人报道。本研究将利用放射性肺纤维化小鼠模型来评估整合素αvβ3拮抗剂西仑吉肽对放射性肺纤维化的影响。方法:我们将150只C57BL/6小鼠平均分为5组,正常对照组、正常给药组、单纯照射组、照射给药低剂量组和照射给药高剂量组。照射组给予小鼠16Gy全胸部单次照射,给药组小鼠每日腹腔注射15mg/kg或75mg/kg西仑吉肽,给药时间均为8周。每月记录各组小鼠的生存和体重状况。利用HE和Masson染色评估照射后第6、16、20周各组小鼠肺纤维化情况。利用羟脯氨酸含量测定和α-SMA免疫组化的方法评估照射后第20周各组小鼠肺纤维化情况。利用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测照射后第20周各组小鼠血清总TGFβ1与活化型TGFβ1分泌情况。利用Real-Time PCR法检测照射后第20周各组小鼠右肺组织Tgfb1、Itgav、Itgb3、Col1a1基因m RNA的表达量。结果:16Gy胸部照射后给予小鼠腹腔注射西仑吉肽能给小鼠带来生存获益,其中照射给药低剂量组(P0.001)较照射给药高剂量组(P=0.04)更为显著。放疗后6周小鼠肺组织HE和Masson染色结果提示,西仑吉肽对于放射性肺损伤急性炎症期并无显著的干预作用。放疗后第20周小鼠肺组织HE、Masson染色、α-SMA免疫组化以及羟脯氨酸含量测定结果显示,照射后每日腹腔注射西仑吉肽可以显著减轻小鼠放射性肺纤维化程度,其中照射给药低剂量组较高剂量组更为显著。Real-Time PCR结果显示,单纯照射组小鼠Tgfb1、Itgav、Col1a1基因m RNA表达量显著高于对照组,但西仑吉肽给药后,Tgfb1、Itgav、Col1a1基因m RNA表达量显著降低,其中以Itgav最为明显(P0.001)。结论:本部分研究首次利用放射性肺纤维化小鼠模型,发现整合素αvβ3拮抗剂西仑吉肽能显著减弱小鼠由射线照射诱发的放射性肺纤维化,为临床上使用西仑吉肽干预放射性肺纤维化提供了理论依据。第二部分西仑吉肽通过TGFβ1/αvβ3-PAI-1通路干预放射性肺纤维化目的:在前一部分的研究中,我们发现整合素αvβ3拮抗剂西仑吉肽能减少小鼠血清TGFβ1的激活,并显著减弱小鼠放射性肺纤维化的程度,但其具体机制不清。本部分研究旨在明确TGFβ1下游诱导放射性肺纤维化的关键靶基因,并探寻西仑吉肽对关键基因的调控作用。方法:采用CCK-8细胞增殖实验检测西仑吉肽对MRC-5人胚肺成纤维细胞的半抑制浓度(IC50)。采用ELISA法检测MRC-5细胞经8Gy照射和西仑吉肽处理后,细胞上清中总TGFβ1与活化型TGFβ1含量。利用基因芯片和蛋白质互作分析的方法,寻找TGFβ1下游诱导放射性肺纤维化的关键靶基因。利用蛋白免疫印迹法(Western Blot)与Real-Time PCR法检测TGFβ1以及西仑吉肽对关键靶基因的调控作用。利用Western Blot和si RNA转染法检测抑制关键靶基因表达后,I型胶原的蛋白表达情况。结果:CCK-8细胞增殖实验结果,西仑吉肽能显著抑制MRC-5细胞增殖,其半抑制浓度(IC50)约在0.5u M左右。ELISA法检测结果提示,不同剂量(0Gy-10Gy)的单次照射MRC-5细胞后,细胞上清中总TGFβ1与活化型TGFβ1含量逐渐增高,其中8Gy照射后的细胞分泌的总TGFβ1(P0.05)与活化型TGFβ1(P0.01)含量较对照组细胞增加最为明显。而西仑吉肽处理细胞后,细胞分泌的总TGFβ1较单纯8Gy组细胞的总TGFβ1分泌量并无明显变化,而活化型TGFβ1显著降低(P0.001)。通过基因芯片和蛋白互作分析法,我们发现纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)是TGFβ1下游诱导放射性肺纤维化的关键靶基因。Western Blot和Real-Time PCR结果表明TGFβ1能调控MRC-5细胞PAI-1的表达,西仑吉肽能抑制PAI-1的表达,而PAI-1si RNA能显著抑制I型胶原的表达。结论:本部分研究提示放射线能通过激活人胚肺成纤维细胞TGFβ1/αvβ3-PAI-1通路诱发放射性肺纤维化。而整合素αvβ3拮抗剂西仑吉肽能通过干预TGFβ1/αvβ3-PAI-1通路关键蛋白的表达,从而减弱放射性肺纤维化的发生。第三部分TGFβ1/αvβ3-PAI-1通路基因单核苷酸多态性与肺癌放射性肺炎相关性研究目的:放射性肺炎是接受放射治疗肺癌患者的常见并发症,限制了放射治疗的疗效。本论文前两部分研究表明TGFβ1/αvβ3-PAI-1在放射性肺损伤中发挥了重要作用。而TGFβ1/αvβ3-PAI-1通路基因单核苷酸多态性与多种炎性疾病或者肿瘤有重要关联。我们推测TGFβ1/αvβ3-PAI-1通路基因单核苷酸多态性与肺癌患者放射性肺炎发生风险之间具有相关性。方法:本前瞻性研究纳入了2008年9月至2014年6月武汉市同济医院肿瘤科收治的169例接受放射治疗的肺癌患者。我们提取了患者外周血全基因组DNA,通过Sequenom Mass Array system对ITGAV、ITGB3、PAI-1基因8个单核苷酸多态性位点进行基因分型分析。用Kaplan-Meier累积概率法评估发生3级或3级以上放射性肺炎的风险,单因素及多因素分析采用Cox比例风险模型对临床因素、PAI-1基因型与放射性肺损伤相关性进行评价。结果:在校正了吸烟状态、年龄、肺功能以及放疗剂量参数等因素后,多变量分析发现,与PAI-1:rs7242 TT基因型相比,GT/GG基因型与"g 3级放射性肺炎的风险较高显著相关(P=0.010)。而PAI-1:rs7242GT/GG基因型联合V20"g 24%或MLD"g 15Gy的患者具有最高的"g 3级放射性肺炎发病风险。结论:本部分研究提示PAI-1基因单核苷酸多态性位点rs7242可以成为肺癌患者放射性肺炎发生的预测因素。
【图文】：

图 1.动物实验流程图。.2 小鼠照射方法使用戊巴比妥钠腹腔注射麻醉小鼠，每次 6 只，。将小鼠置于照射板上，用记号笔勾出小鼠胸部区域，范围是胸骨角至肋下缘用胶布将小鼠仰卧位固定，保证小鼠胸部处于同一水平线紧密排列。使用厚铅板遮蔽小鼠胸部以外的其余区域，将照射板置于生物辐射仪内，给单次全胸部 16Gy 照射。组一与组二小鼠只给予戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，但不进行照射处理。.3 观察与给药照射当日开始，每日观察小鼠的活动情况，有无出现死亡。观察有无脱毛，烂现象，并每日给予每组小鼠腹腔注射指定浓度的西仑吉肽或 PBS 溶液，给

结 果1. 小鼠生存情况与体重变化如图 2 所示，在 28 周的观察时间内，正常对照组与西仑吉肽单纯给药组小鼠均未出现死亡。而单纯放疗组小鼠生存时间较对照组小鼠显著缩短，到观察终点 28 周时，最终仅有2只小鼠存活，中位生存时间仅为87天。照射给药低剂量组（每日15mg/kg西仑吉肽腹腔注射 8 周）在 28 周时有 4 只小鼠死亡，，照射给药高剂量组（每日 75mg/kg西仑吉肽腹腔注射 8 周）在 28 周时有 7 只小鼠死亡，log-rank 检验提示，两组照射给药组小鼠生存显著优于单纯照射组，其中照射给药低剂量组（P < 0.001）较照射给药高剂量组（P = 0.04）更为显著。此结果提示，16Gy 胸部照射后给予小鼠腹腔注射西仑吉肽能给小鼠带来生存获益，其中照射给药低剂量组较照射给药高剂量组更为显著。
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R730.55;R734.2

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本文编号：2704546