巨噬细胞来源的血红素加氧酶-1在脓毒症心功能不全中的作用及其机制

发布时间：2020-06-09 09:25

【摘要】：研究背景:脓毒症是全身炎症性疾病,可导致心功能不全,死亡率高。巨噬细胞是重要的炎症细胞,在脓毒症中发挥重要的作用。诱导型一氧化氮合酶(iNOS)在激活的巨噬细胞中高度表达,与炎症和氧化应激密切相关。传统的观念认为炎症和氧化应激可激活血红素加氧酶-1(HO-1),催化血红素产生的代谢产物具有抗炎和抗氧化应激作用。但是,另有研究提示巨噬细胞HO-1具有促炎作用。至于巨噬细胞HO-1在脓毒症心功能不全中的作用未见报道。通过应用腹腔注射脂多糖(LPS)诱导小鼠脓毒症心功能不全模型,我们的前期研究发现LPS显著激活心脏中浸润的巨噬细胞HO-1的表达,离体实验中HO-1基因沉默可显著下调LPS诱导的巨噬细胞iNOS蛋白的表达水平。因此,我们提出科学假设:巨噬细胞来源的HO-1可以促进脓毒症心功能不全的发生。本研究旨在阐明巨噬细胞来源的HO-1在脓毒症心功能不全中的作用及其机制,为临床寻找新的作用靶点提供科学依据。研究方法:应用髓系特异性HO-1敲除小鼠,构建LPS诱导的脓毒症心功能不全模型,采用心脏超声、免疫荧光染色、western blot及定量PCR等方法,观察髓系HO-1敲除对LPS诱导的小鼠脓毒症心功能不全及生存率的影响;应用HO-1基因沉默技术或其抑制剂,采用western blot、定量PCR及激光共聚焦等方法,观察LPS诱导的巨噬细胞中HO-1对iNOS调控的影响;应用质粒构建、质粒转染、免疫共沉淀(Co-IP)等技术,培养过表达质粒的HEK293T及RAW264.7细胞,探讨HO-1对iNOS蛋白调控的分子机制。研究结果:髓系HO-1敲除显著改善了 LPS诱导的脓毒症心功能不全,并显著降低死亡率。与此同时,髓系HO-1敲除显著降低了脓毒症小鼠心脏中心肌细胞凋亡、浸润的巨噬细胞过氧亚硝酸盐生成和iNOS的蛋白表达,但对活性氧(ROS)生成无影响,iNOS的mRNA水平无显著改变。我们进一步的研究发现抑制巨噬细胞HO-1的表达可促进iNOS蛋白的溶酶体降解而非蛋白酶体降解,且巨噬细胞HO-1调控iNOS蛋白表达不依赖于其代谢物亚铁离子,一氧化碳和胆红素。应用巴弗洛霉素A1抑制iNOS溶酶体降解,显著阻碍了髓系HO-1敲除对小鼠脓毒症心功能不全的保护作用。应用Co-IP等技术,证实了 HO-1与iNOS的黄素单核苷酸(FMN)结构域相互结合,从而进一步阻止巨噬细胞中iNOS与微管相关蛋白1轻链3(LC3)的结合以及随后在溶酶体中的降解的分子机制。结论:研究结果表明巨噬细胞来源的HO-1具有促小鼠脓毒症心功能不全的作用,是通过抑制iNOS的溶酶体降解的机制,并进一步阐明了 HO-1对iNOS溶酶体降解作用的分子机制。
【图文】：

４．１脓毒症诱导心功能减退逡逑ＬＰＳ腹腔注射野生型（ＷＴ）小鼠后１２小时用超声心动图检测心功能，我们发逡逑现，与对照ＰＢＳ组比较，ＬＰＳ组心功能显著降低（图１Ａ－Ｂ），并且小鼠生存率显著逡逑降低（图１Ｃ）。逡逑Ａ逦Ｂ逦Ｃ邋ｉｃｏｎ逦；逦＝ｒｓｒ逡逑１０0１逦－逦６０ｊ逦－逦＿８０－逦１逦—ＬＰＳ逡逑ｉ邋．．．逡逑ＰＢＳ逦ＬＰＳ逦ＰＢＳ邋ＬＰＳ逦ＰＢＳ邋ＬＰＳ逦Ｗ８邋２－４邋３－０．３Ｗ２４＇８邋５＾ｂ逡逑ｈｏｕｒｓ逡逑图１脓毒症诱导心功能减退。Ａ和Ｂ，腹腔注射ＰＢＳ或ＬＰＳ后１２小时的ＷＴ小逡逑鼠的超声心动图，射血分数（ＥＦ）和短轴缩短率（ＦＳ）（每组ｎ＝邋８）；邋Ｃ，腹腔注逡逑射ＰＢＳ或ＬＰＳ的ＷＴ小鼠的存活率（ＰＢＳ组ｎ邋＝邋８，邋ＬＰＳ组ｎ＝１２）；…尸＜０．００１。逡逑４．２脓毒症心脏ＨＯ－１表徸激活逡逑为了评估ＨＯ－１在脓毒症心功能不全中的作用，，我们进一步检测了心脏组织中逡逑Ｈ０－１的水平。ＷＴ小鼠暴露于腹腔注射ＬＰＳ或等体积的ＰＢＳ，注射后１２小时收集心逡逑脏组织标本，比较了邋ＬＰＳ和ＰＢＳ两组心脏组织中Ｈ０－１蛋白表达水平和巨噬细胞浸润逡逑水平。Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ检测和免疫荧光染色显示，在ＬＰＳ诱导心脏中ＨＯ－１蛋白表达和逡逑巨噬细胞浸润数目均显著增加（图２Ａ－Ｂ）。值得注意的是

Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ检测和免疫荧光染色显示，在ＬＰＳ诱导心脏中ＨＯ－１蛋白表达和逡逑巨噬细胞浸润数目均显著增加（图２Ａ－Ｂ）。值得注意的是，Ｈ０－１在炎性巨噬细胞逡逑中表达尤其明显而非心肌细胞（图２Ｂ，图３Ａ）。以上数据提示巨噬细胞ＨＯ－１参与逡逑ＬＰＳ诱导的脓毒症心功能不全。逡逑３５逡逑
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R459.7

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本文编号：2704486