血清淀粉样蛋白A、C反应蛋白荧光免疫层析联合检测方法的建立

发布时间：2020-06-10 06:10

【摘要】：目的:建立一种可同时定量检测人血清中SAA、CRP含量的荧光免疫层析方法。方法:采用双抗体夹心原理制备SAA、CRP联合检测荧光免疫层析试纸条,对标记、包被抗体量进行研究后,对试纸条线性范围、精密性、交叉反应等性能指标进行评价。结果:最终确定SAA、CRP标记量均为20μg,包被浓度分别为2 mg/ml、1.5 mg/ml,SAA、CRP线性范围为0.78～200μg/ml;批内精密性与批间精密性均小于15%,平均回收率分别为101.7%和103.5%;且SAA和CRP两种抗原进行联合检测时无交叉反应,与西门子BN ProSpec~?特定蛋白分析系统上平行检测80份临床血清其相关性良好。结论:初步建立了联合定量检测SAA、CRP的荧光免疫层析方法,为感染性疾病的早期筛查提供一种新的检测手段。
【图文】：

示意图,试纸,荧光,层析

参照文献[5,6],采用EDC-NHS两步法活化荧光微球,取5 μl荧光微球加入500 μl 0.05 mol/L 硼酸缓冲液(pH8.0)漩涡振荡混匀后,加入50 μl EDC溶液(1 mg/ml)和 50 μl NHS溶液(1 mg/ml) 作为活化剂混匀后,振荡活化30 min;15 000 r/min离心20 min,弃上清;加入800 μl 0.05 mol/L硼酸缓冲液(pH8.0)复溶沉淀后,再加入20 μg 抗SAAⅠ抗体,室温下振荡偶联2 h;15 000 r/min 离心20 min,弃上清;加入1 ml微球保护液复溶沉淀后,加入10 μl 1%BSA溶液振荡封闭1 h,置于4℃保存备用。荧光微球标记抗CRP Ⅰ抗体:加入20 μg 抗CRP Ⅰ抗体,其余步骤同荧光微球标记抗SAA Ⅰ抗体。荧光微球标记兔IgG多克隆抗体:加入10 μg 兔IgG多克隆抗体,其余步骤同荧光微球标记SAA Ⅰ 抗体。将3种免疫微球按照体积比1∶1∶1混匀后,按照5 μl/cm喷涂到微球结合垫上制备成微球垫,37℃干燥2 h。采用三维平面点膜喷金仪,按1 μl/cm将2 mg/ml 鼠抗兔IgG单克隆抗体、 1.5 mg/ml 抗SAA Ⅱ单克隆包被抗体、1.5 mg/ml 抗 CRPⅡ单克隆包被抗体包被于NC膜上分别作为T1线、T2和C线,37℃干燥2 h。按试纸条组装方式,组装好后用切条机切成3.9 mm宽的试纸条如图1,装于带有干燥剂的铝箔袋中密封,置于2～8℃保存备用。1.2.2 试纸条的检测

标准曲线,标准曲线,精密性,试纸

随机抽取3个不同批次的 SAA、CRP联合检测免疫层析试纸条,分别对浓度为 5、10、50 μg/ml的样本进行精密性检测。SAA批内精密性依次为9.59%、7.13%、4.49%,批间精密性依次为9.44%、6.92%、5.76%;CRP批内精密性依次为9.59%、7.13%、4.49%,批间精密性依次为9.44%、6.92%、5.76%。本方法制备的试纸条其批间和批内变异系数均小于15%,符合精密性要求。图3 CRP标准曲线

【相似文献】