核酸错配对DNA连接酶反应的单位点核酸变异检测的影响

发布时间：2020-06-11 10:58

【摘要】：基因变异最常见的形式是单核苷酸多态性(single-nucleotide polymorphism,SNP),它与人类疾病、药物效率有密切联系。SNP检测已被认为是早期诊断恶性肿瘤风险评估有前途的工具。全面了解单核苷酸多态性基因分型可以实现有价值的信息,并用来指导临床诊断和个体用药的发展,所以,简单、精准的SNP检测是非常重要的。由于较低的商业成本以及核酸底物识别的灵活性,T4 DNA连接酶被广泛应用于生物分子工程,特别是特定核酸序列的等位特异性连接检测。本论文探究了以T4 DNA连接酶为主的不同连接酶介导的连接反应中引入额外的错配对于目的基因片段上的单碱基变异位点的识别所产生的影响。论文以锁式探针成环反应为模型,系统性地验证了不同DNA连接酶的连接活性,分析了引入额外错配对连接酶特异性的影响。研究结果表明,引入额外的碱基错配,提高了T4 DNA连接酶对单碱基变异的目的核酸的特异性。对单碱基DNA突变检测,分析发现在连接点相邻位置引入额外的错配,可以明显提高T4 DNA连接酶的特异性。其中,最有效的错配碱基对可使T4 DNA连接酶的特异性提高600多倍。对单碱基RNA突变检测,分析发现对不同碱基检测时,额外引入错配的最佳位置不同,且T4 DNA连接酶对于DNA底物的识别灵敏度高于RNA/DNA复合底物的识别。此外,还对Taq DNA连接酶介导的连接反应进行分析,实验结果表明额外引入的错配对于Taq DNA连接酶对底物识别的特异性影响不大。本论文从不同连接酶的连接效率、对不同底物的识别特异性进行研究,确认了额外引入的错配可以提高T4 DNA连接酶对底物识别的特异性,提高了单碱基突变检测的精准度。所得结论对以锁式探针为模型的特异性核酸位点检测技术有指导意义,同时对发展临床诊断技术和个体化用药有推进作用。
【图文】：

温度循环,步骤

并用来指导临床诊断和个体用药的发展[12]。序列检测技术 SNP 的检测技术有很多，但主流的技术大致可以、测序技术、恒温扩增技术。 PCR 技术 PE-Cetus 公司发明了具有划时代意义的聚in reaction, PCR），它是一种应用十分广泛的体外括：DNA 模板、一对引物、dNTPs、热稳定的聚、退火和延伸（图 1-1）。高温变性是使 DNA 双引物结合到单链上；延伸是聚合酶发挥作用。

原理图,原理,探针,荧光基团

要求不高的定量 PCR 检测。性荧光探针法是在 PCR 反应体系内添加一对引物的同时，加入一种特异性的探针序列，从而通过检测加入的荧光信号来定性。荧光探针：一是探针本身带有强烈荧光的荧光分子，通过结构设计与淬aqman 探针；另一种是探针带有可以通过与核酸的结合改变自分子，如 LightUp 探针。n 探针（图 1-2）是一段寡核苷酸序列，它的 5’端带有荧光基基团。因淬灭基团与荧光基团距离较近，，荧光基团发出的荧光仪器不能检测到信号。但是当探针与目标序列结合，PCR 延所结合位置时，因 Taq DNA 聚合酶有 5’-3’的外切酶活性，会aqman 探针降解，从而使荧光分子与淬灭基团分离，发出荧光检测到荧光信号并进行收集、分析[14; 15]。
【学位授予单位】：天津大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R440

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