3D生物打印技术辅助构建组织工程尿道研究

发布时间：2020-06-12 04:00

【摘要】：背景和目的:各种原因(导尿操作、骨盆骨折或感染)引起的尿道狭窄通常需要尿道重建术来恢复尿道的连续性,临床上常采用自体组织(如颊粘膜或包皮)进行尿道重建,但此类自体材料来源有限,因此,通过组织工程来构建人工尿道,成为解决尿道重建材料缺乏问题的重要手段。近年来,三维生物打印(3D生物打印)在组织工程领域得到广泛应用,相比于组织工程生物材料传统的“细胞-支架”策略,3D生物打印可在支架塑形的同时将种子细胞均匀分布在支架内部,从而提高构建生物材料的效率。但3D生物打印过程中往往种子细胞活力受损,导致其不能在支架内发挥细胞功能。向平滑肌细胞定向诱导分化的人脂肪干细胞(human adipose derived stem cells,hADSCs)是尿道组织工程的重要种子细胞,传统的诱导方式耗时相对较长,难以短时间内获得大量定向分化的人脂肪干细胞,限制了利用定向分化后的hADSCs来构建组织工程化尿道的效率。在本研究中,我们将探索改进诱导hADSCs定向分化为平滑肌细胞的方法,并提升诱导后的hADSCs在3D生物打印组织块中的细胞活力。进一步我们将利用诱导后的hADSCs与3D生物打印相结合,以组织工程手段构建人工尿道,为今后在动物尿道缺损模型中的尿道重建提供新思路和新手段。材料和方法:在本研究中,我们在添加了人转化生长因子(transforming growth factor β1,TGF-β1)的诱导培养基中悬滴培养hADSCs,形成微组织球(microtissues,MTs),将诱导后的微组织球与普通贴壁诱导的hADSCs进行免疫荧光和免疫蛋白印记检测平滑肌特异标志物表达量的差异。接下来将诱导后的MTs和hADSCs应用于3D生物打印,通过活死细胞染色及CCK-8检测两组细胞存活及增殖状况。接下来我们将3D生物打印块包埋在裸鼠皮下孵育1周,并取出后在其表面种植由人输尿管组织获取的尿路上皮细胞(human urothelial cells,hUCs),构建人工尿道,对其进行组织学染色观察内部形态以及肌纤维和胶原纤维的形成、免疫荧光染色评估新生血管和尿路上皮层的形成、免疫组化染色检测内部细胞表型。结果:在诱导3天后,MTs组的平滑肌特异性标志物a smooth muscle actin(a-SMA)和Smoothel in的表达量均显著高于hADSCs组,半定量分析结果提示MTs组和hADSCs组 α-SMA 表达量分别为 0.218±0.077 和 0.082±0.007(P0.001),Smoothelin 表达量分别为0.319±0.02和0.178±0.06(P0.001)。活死细胞染色提示在打印后不同的时间节点,MTs组的存活细胞数比hADSCs组更多(平均存活细胞率为88.16%±3.98%和61.76%±15%,P=0.0396),CCK-8检测提示MTs组细胞活力在打印后快速恢复至较高水平。皮下包埋1周后,HE和masson三色染色提示MTs组在体内仍然能够保持其大体形态,周围有血管样结构形成,并且形成了较多的肌纤维和少量的胶原纤维;而hADSCs组则变为圆形,周围缺乏血管样结构。免疫组化染色提示诱导后MTs在体内仍表达平滑肌特异性标志物a-SMA和Smoothel in。免疫荧光染色提示MTs组在体内形成了环状的新生血管结构,且在种植尿路上皮细胞后,表面形成了连续的尿路上皮层。结论:将悬滴诱导培养与3D生物打印结合,并采用裸鼠皮下包埋孵育并种植尿路上皮细胞的方法,我们构建了组织工程化人工尿道,通过相应的实验观察了其中的种子细胞形态,检测了种子细胞存活状况和细胞表型等指标,为下一步动物尿道缺损模型重建提供了新思路和新手段。
【图文】：

-4.100720家系患者纯音测听结果

图１－１－８．邋１００７０８１家系先证者纯音测听结果逡逑
【学位授予单位】：中国人民解放军医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R318.16;R699.6

【参考文献】

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本文编号：2708973