基于微液滴数字PCR的呼吸道真菌检测方法建立及临床应用研究

发布时间：2020-06-12 12:28

【摘要】：真菌是自然界常见且种类繁多的异养型真核生物,其中与对人类健康产生影响的约300多种,造成感染的类型主要分为浅表感染(例如真菌性皮肤病)和深部感染(或称侵袭性真菌感染)。全世界范围内约有17亿人受到浅表真菌感染的影响,但其不构成生命威胁。侵袭性真菌感染与之相反死亡率极高,以侵袭性曲霉病为例,部分患者人群中诊断和治疗的延误会导致死亡率接近100%。每年因侵袭性真菌感染导致死亡的患者人数高达到150万人,免疫抑制人群增加(例如HIV、血液病、器官移植患者等)和侵入性医疗干预是导致侵袭性真菌感染呈上升趋势的主要原因。肺是最常见的深部真菌感染受累器官,因此对呼吸道常见致病真菌进行快速早期检测具有很高的临床应用价值。念珠菌和曲霉是呼吸道中最常见的条件致病真菌,本研究中以痰液样本为检材,首次建立了基于微液滴数字PCR(Droplet digital PCR,ddPCR)的呼吸道中多靶标真菌(念珠菌、曲霉)检测方法,初步对该方法在肺曲霉病诊断的临床应用情况进行了研究。研究结果表明,该方法的灵敏高、特异性好、临床适用性强,是一种有前景的临床常见呼吸道真菌快速精准检测方法。目前用于肺部真菌感染检测的新型方法主要有G试验、GM试验、质谱、测序、PCR等,对应样本来源主要有静脉血、肺泡灌洗液、支气管刷片和肺组织样本,此类样本的获取需侵入性操作对患者具有创伤性。痰液是无需侵入性操作即可获取的非无菌临床样本,目前对痰液样本进行真菌感染检测的报道较少,主要原因是其成分的复杂性。本研究中基于痰液样本和ddPCR技术建立了对8种呼吸道常见真菌(白色念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉和土曲霉)的检测方法并进行了验证。实验结果表明该方法的分析灵敏度高,所有真菌靶标在2-2×104拷贝的检测范围内的线性好,R2均大于0.99,引物探针特异性强,与其他细菌、真菌或人细胞株无交叉反应,对临床曲霉或念珠菌分离株检出率为100%。该方法对仅含5个曲霉(烟曲霉和黄曲霉)孢子的模拟痰液样本可进行有效检出,进一步对已知培养结果的29例痰液样本进行检测,结果显示一致性为96.5%,其中1例丝状真菌阴性培养样本中有烟曲霉检出,7例阳性培养结果样本中检出真菌混合阳性结果。最终通过二代测序方法对ddPCR检测结果进行验证,二代测序结果证明了 ddPCR检测结果的精准可靠。随后ddPCR真菌检测方法被首次应用于肺曲霉病的诊断。肺曲霉病是由曲霉感染引起的严重疾病,已有研究表明曲霉在样本中的载量与感染状态相关联,目前曲霉载量尚无定量标准且报道较少。ddPCR方法具有绝对定量和对复杂样本分析的优势,可对痰液样本中曲霉载量进行准确定量,.研究中选取了可涵盖临床90%以上曲霉的4种曲霉靶标(烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉、土曲霉)进行检测。首先对收集的18位肺曲霉病患者和99位非肺曲霉病患者进行了临床特征和风险因素分析,分析结果表明肺结核、支气管扩张和长期使用激素或免疫抑制剂是肺曲霉病的主要风险因素。160例临床样本的ddPCR检测结果显示,肺曲霉病组患者的曲霉检出率为84.2%,非肺曲霉病组患者的曲霉检出率为8.2%,肺曲霉病组检出菌株以烟曲霉为主。随后肺曲霉病组患者进一步分为包含或不包含变应性支气管肺曲霉菌病(allergic bronchopulmonary aspergillosis,ABPA)组进行受试者工作特征曲线(Receiver Operating Characteristic curve,ROC)分析,结果显示前者在检测阈值为20.2拷贝时的灵敏度和特异性可达81.6%和95.1%,后者在检测阈值为39.9拷贝时的灵敏度可达94.7%和99.2,两者的曲线下面积(Area Under Curve,AUC)值均大于0.9,表明该方法对肺曲霉病的诊断价值高。最后,4位肺曲霉病患者在不同时间点采集的共计17份痰液样本检测结果被用于肺曲霉病的病情监测分析,结果表明ddPCR的检测结果变化和患者病情的进展或改善的趋势一致。本研究以痰液作为检测样本,以ddPCR技术为检测平台,建立了一种无创、精确、快速、可靠的呼吸道中真菌检测方法。该方法可对呼吸道中痕量常见真菌进行准确鉴定,对复合感染样本中的每种真菌靶标亦可有效检出,灵敏度高,特异性好,检出率高。基于ddPCR技术绝对定量特性,该检测方法可为样本中真菌准确载量的确定提供一种有效工具,研究结果表明本方法可被用于肺曲霉病的诊断,将来有望为肺曲霉病患者的病情监测提供一种有效的解决方案。
【图文】：

曲霉,悬液,孢子,菌丝

逦１３得到的溶液重新上柱，１４０００ｒｐｍ离心２ｍｉｎ。即得到痰液样。逡逑孢子获取和计数逡逑孢子悬液的获取逡逑孢子被用于本实验中模拟样本的制备，选择曲霉孢子原因如下：达，在菌丝状态下难以对投入基因组数量进行计数，二、相比念更高的曲霉细胞壁更加坚固，更适用于检测核酸提取方法。曲霉京协和医院检验科提供，具体菌种为经Ｓａｎｇｅｒ测序鉴定后的临床黄曲霉，依据医院真菌孢子悬液制备流程滤去菌丝后制备了浓度大曲霉与黄曲霉孢子悬液。逡逑孢子的计数逡逑———－－逡逑

靶标,黑曲霉,黄曲霉,检测情况

图１．５靶标内同一物种不同分离株的检测情况Ａ：邋４种曲霉菌对应探针种内不同逡逑分离株的液滴检测情况，自上而下依次是烟曲霉６株、黑曲霉３株、黄曲霉３株、逡逑土?
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R519;R440

【相似文献】