海带多糖通过激活Nrf2通路保护放射诱导下颌下腺氧化应激损伤

发布时间：2020-06-12 22:49

【摘要】：第一部分海带多糖对放射诱导下颌下腺氧化应激损伤的保护作用目的:采用~(60)Coγ射线来建立放射性下颌下腺损伤的小鼠模型并给予海带多糖干预,通过观察小鼠一般情况,唾液流量,颌下腺指数,下颌下腺大体形态,病理形态以及氧化应激指标ROS,MDA,炎性因子TNF-α,IL-6和TGF-β的变化,来探讨海带多糖(Laminaria japonica polysaccharides,LJP)干预对放射诱导下颌下腺氧化应激损伤的影响。方法:将96只健康清洁级昆明小鼠随机分为4组:对照组,LJP组,放射组(IR组)和放射+LJP组(IR+LJP组),每组24只。观察和记录小鼠活动,皮毛颜色等情况,每隔3d对各组小鼠体重,饮水量和摄取饲料量进行测量;IR组和IR+LJP组小鼠给予60Coγ射线一次性照射15Gy建立放射性颌下腺损伤的小鼠模型,在照射前3d开始腹腔注射海带多糖(100mg/kg/d),连续给药7d,即于照射后4d结束,分别于照射后1d,7d,28d和56d检测小鼠唾液流量,使用毛果芸香碱诱导获得30min内唾液总量,按照小鼠体重进行统一标准化处理;观测下颌下腺的大体形态,分别对小鼠体重和下颌下腺进行称量,计算颌下腺指数,HE染色观察其组织病理学变化;并检测下颌下腺氧化应激指标ROS和MDA表达水平的变化;采用ELISA检测小鼠血清中炎性细胞因子TNF-α,IL-6和TGF-β分泌的变化。结果:1.各组小鼠一般情况的变化:与对照组比较,IR组小鼠对触碰敏感,易烦躁不安,毛发易脱落,并且毛发脱落部位易发生溃疡,而LJP+IR组小鼠上述异常情况并不明显;IR组小鼠在照射后饮水量明显增多(P0.05),在放射后7d饮水量达到高峰,而摄食量和体重明显减少(P0.05);与IR组比较,随着时间延长给予LJP干预的放射小鼠摄食量和体重开始逐渐恢复(P0.05),饮水量逐渐减少(P0.05);2.各组小鼠唾液流量的变化:与对照组相比,LJP组小鼠的唾液流量差异无统计学意义(P0.05),而IR组唾液流量在照射后显著减少,并随着照射时间的延长,唾液流量呈现逐渐下降的趋势(P0.05);经LJP干预后的放射小鼠唾液流量在照射后7d开始逐渐恢复升高(P0.05);3.下颌下腺大体形态及其指数变化:与对照组相比,在照射后7d开始,IR组小鼠颌下腺出现充血肿胀,其颌下腺指数明显升高(P0.05);LJP+IR组小鼠颌下腺充血肿胀改善,颌下腺指数低于放射组(P0.05);4.HE染色显示:与对照相比,IR组颌下腺组织中出现导管腺泡出现明显空泡化,核固缩,导管扩张和炎细胞浸润等病理变化;而LJP+IR组小鼠颌下腺的空泡化和炎细胞浸润等病变程度明显轻于IR组;5.氧化应激指标ROS和MDA结果显示:与对照组相比,LJP组颌下腺中ROS和MDA含量差异无统计学意义(P0.05),而照射后IR组SMG中ROS和MDA含量显著升高(P0.05);经LJP干预后的放射小鼠颌下腺组织中ROS和MDA的含量降低(P0.05),在放射后56d恢复到对照组水平;6.ELISA检测结果显示:与对照组相比,放射后IR组及LJP+IR组小鼠血清中TNF-α和IL-6含量均明显升高(P0.05),而IR组TGF-β1含量在放射后1d和56d时明显升高(P0.05);LJP+IR组的TNF-α,IL-6和TGF-β含量明显低于IR组(P0.05)。结论:1.γ射线可诱导下颌下腺的氧化应激损伤和炎症反应。2.LJP对放射诱导的下颌下腺损伤保护作用可能与增强其抗氧化能力有关。第二部分基于Nrf2通路研究LJP对放射诱导下颌下腺氧化应激损伤保护作用的分子机制目的:通过进一步探讨与氧化应激有关的重要通路Nrf2中Nrf2/HO-1,NQO1,/MnSOD以及线粒体蛋白Sirt3表达位置和变化规律,来阐明海带多糖干预对放射诱导下颌下腺氧化损伤保护作用可能的分子机制。方法:采用免疫荧光染色,免疫组化染色,实时荧光定量PCR和蛋白免疫印迹等实验方法来共同检测验证LJP干预对Nrf2/HO-1,NQO1,MnSOD以及线粒体蛋白Sirt3在下颌下腺组织中表达位置以及表达变化规律的影响。结果:1.免疫荧光染色显示:对照组和LJP组Nrf2均表达在腺泡细胞的胞浆中,而IR组和IR+LJP组颌下腺中Nrf2表达由胞浆转位到细胞核;与对照组相比,LJP组小鼠颌下腺中MnSOD表达差异无统计学意义(P0.05),而IR组和LJP+IR组MnSOD表达在放射后7d开始明显升高(P0.01);与IR组相比,给予LJP处理的放射小鼠颌下腺中MnSOD表达进一步明显升高(P0.01);2.免疫组化染色显示:与对照组比较,LJP组HO-1和NQO1表达差异无统计学意义(P0.05),而IR组和IR+LJP组HO-1和NQO1表达在放射后7d开始明显增加(P0.05),IR组中Sirt3的表达明显降低(P0.05);给予海带多糖干预的IR+LJP组小鼠颌下腺中HO-1、NQO1和Sirt3表达在放射后7d开始明显高于IR组(P0.05);3.荧光定量PCR显示:与对照组相比,LJP组差异无统计学意义(P0.05),而IR组SMG中Nrf2,HO-1,NQO1和MnSOD的mRNA水平在放射后明显增加(P0.05),Sirt3的mRNA水平明显减少(P0.05);给予LJP处理的放射小鼠SMG中Keap1和Nrf2,HO-1,NQO1,MnSOD和Sirt3的mRNA水平明显高于IR组(P0.05);4.蛋白免疫印迹显示:与对照组相比,LJP组差异无统计学意义(P0.05),IR组和LJP+IR组颌下腺中Nrf2,HO-1和NQO1的蛋白水平明显增加(P0.05);与IR组比较,给予LJP处理的放射小鼠Nrf2,HO-1和NQO1蛋白水平进一步增加(P0.05)。结论:1.海带多糖可能通过激活Nrf2信号通路改善放射诱导的氧化应激损伤和炎症反应2.海带多糖可能通过上调线粒体蛋白Sirt3表达来改善氧化应激损伤和炎症反应
【图文】：

于照射前 3d 给予 LJP 组和 IR+LJP 组小鼠腹腔注射 0.1%Lg/d，持续到照射后 4d；同时对照组和 IR 组小鼠腹腔注射等同l。物模型的建立 3d 后，将 IR 组和 IR+LJP 组小鼠麻醉，固定于自制的“放定头部身体不能移动，一次性给予 60Coγ射线照射剂量为 15G表的距离为 80 cm，，剂量吸收率为 1250cGy/min，使小鼠颈部分暴露于透过铅板孔的射线下，照射颈部区域，其它部位受射线照射，如图 1-1 所示。对照组和 LJP 组小鼠麻醉后放置相予照射剂量为 0Gy。照射完成后观察并记录明显移动或死亡，上述情况视作造模失败，将其剔除。

收集及处理完唾液的小鼠进行眼球采血；小鼠；要取血一侧小鼠的胡须毛发；眼球根部，将其快速摘出；血液：收集量约为 1.2mL-1.8ml/只；血清：将血液于室温静置 4h 后离心，4000r/m，10清于灭菌的离心管中，-80℃冰箱保存。图 1-2 唾液流速测量Figure 1-2 Saliva flow rate measurement
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R730.55;R78

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本文编号：2710222