Parkin在甲基苯丙胺诱导的α-突触核蛋白异常降解中的作用机制

发布时间：2020-06-18 14:10

【摘要】：研究背景:甲基苯丙胺(Methamphetamine,METH)是一种苯丙胺类精神兴奋剂(Amphetamine-Typed Stimμlant,ATS),易溶于水或酒精,其盐酸盐为透明纯白结晶体,晶莹剔透,状似冰,又因其毒性剧烈,俗称“冰毒”。METH小剂量时有欣快抗疲劳的作用,反复吸食易成瘾,长期滥用会产生抑郁、疲劳、易怒等精神病状态,甚至可能导致死亡。据统计,METH在全球范围内被广泛滥用,给社会公共卫生和社会治安带来的危害极大。研究报道,METH含苯环结构,与儿茶酚胺类神经递质的结构很相似,对全身各个系统均有毒害作用,其中对中枢神经系统的作用最大,主要表现为多巴胺能神经元的损伤,可导致与帕金森病等神经退行性疾病相似的特征性病理学改变。因此,对METH毒性及其防治的研究已经成为全世界面临的难点及热点。多年来,本课题组一直致力于METH神经毒性分子机制的研究,在前期研究体内外实验模型中发现,α-突触核蛋白(α-synuclein,α-Syn)在METH诱导所致的细胞及动物大脑氧化应激损伤、线粒体功能损害及多巴胺能系统损伤中发挥了重要的作用。α-Syn是由140个氨基酸组成的小分子蛋白,表达于中枢神经系统突触前及核周。已有研究表明,生理条件下,α-Syn表达量较低,是可溶性的非折叠蛋白,其与多巴胺摄取、突触的可塑性及囊泡的维持等密切相关,对神经元起到保护作用;而在病理条件下,α-Syn表达异常,可形成β-折叠寡聚体,称为初原纤维,进一步形成原纤维、纤维、寡聚体等形式。近年来研究表明,过量表达的α-Syn对神经元有细胞毒性。研究发现,α-Syn是路易氏小体(Lewy's body)的主要成分,而路易氏小体是神经退行性疾病的特征性病理结构。因此,α-Syn被认为是与阿尔茨海默病(AD)、帕金森病(PD)等神经退行性疾病密切相关的蛋白。前期研究发现,随着METH浓度升高,α-Syn的表达水平及细胞的损伤程度呈增强趋势,在电镜下发现METH作用后SH-SY5Y细胞内出现多个类似路易小体、多层漩涡排列的均匀物质;动物研究表明,METH的中毒C57小鼠模型中皮质、海马、中脑、纹状体等相关脑区中α-Syn的表达明显升高,出现与神经退行性疾病相类似的病理改变。在干扰α-Syn表达的METH中毒SH-SY5Y细胞模型中,检测到α-Syn蛋白水平降低,细胞的氧化应激损伤和凋亡都有所减少;而且在干扰α-Syn表达的METH中毒C57小鼠模型中,动物异常兴奋、静止性震颤及姿势不稳等症状减少,脑组织中检测到α-Syn表达量减少,神经元凋亡有所缓解。因此,我们推测异常表达的α-Syn作为重要的靶蛋白参与了神经损伤,产生神经毒性。抑制α-Syn异常表达及促进其快速降解能否减缓神经毒性成为目前研究的热点。泛素蛋白酶体和自噬溶酶体途径是真核细胞清除细胞内异常蛋白质和细胞器的两个主要路径。蛋白酶体是一个多蛋白复合物通道,主要降解短寿命的核及胞质蛋白。蛋白底物必须折叠后通过狭窄的圆形蛋白酶体,这也限制了蛋白低聚物和聚集体的降解。Parkin在泛素蛋白酶体降解蛋白的过程中具有E3连接酶的作用,Parkin蛋白的缺失或功能缺陷可能导致底物蛋白不能被有效降解而堆积,产生毒性作用。研究发现α-Syn是Parkin的底物蛋白,Parkin蛋白的缺失或功能缺陷可能导致α-Syn不能被完全降解而增多,并且会增加α-Syn 129位点的丝氨酸磷酸化(phospho Ser129,pS129 α--Syn)修饰形式,进一步导致α-Syn聚集,形成寡聚体,产生细胞毒性,导致多巴胺能神经元的损伤。我们在前期试验中发现,METH处理SH-SY5Y细胞后,细胞内Parkin蛋白表达量降低,神经毒性增强。然而METH诱导α-Syn增多及Parkin蛋白对降解α-Syn的机制研究尚不清楚,有待进一步证明。本研究建立METH中毒的细胞模型及动物模型,通过检测α-Syn及其丝氨酸129位点磷酸化水平pS129 α-Syn、Polo-样激酶2(PLK2)、蛋白酶体活性标志分子CD3δ、凋亡相关蛋白Caspase-3、PARP及Parkin等指标,验证METH诱导的神经毒性作用;然后通过建立过表达Parkin的稳定细胞株及动物模型,检测上述分子的变化并研究其在METH诱导的神经毒性中的作用,为METH导致的神经损伤治疗提供理论基础。目的:建立METH中毒的体内外模型,初步探讨α-Syn在泛素蛋白酶体途径中降解障碍而引起神经元损伤中的作用。利用分子生物学技术、细胞生物学技术、神经生物学技术等,通过α-Syn及其丝氨酸129位点磷酸化水平pS129 α-Syn、PLK2、CD3δ、Caspase-3、PARP及Parkin等指标的检测,从而研究METH诱导的氧化应激对神经元的损伤作用。再通过SH-SY5Y细胞Parkin过表达慢病毒转染实验及C57小鼠纹状体立体定位技术进一步明确Parkin在α-Syn异常表达中所起的作用,以及METH、Parkin和α-Syn这三者之间的联系,为METH在神经系统损伤机制研究中提供新的靶点。方法:1.蛋白酶体抑制剂MG132处理细胞用含10%新生胎牛血清(FBS)的DMEM-F12培养基接种SH-SY5Y细胞至6cm培养皿或6孔板中,于37℃和5%CO2条件的温箱中培养,待6孔板中细胞长至 70%～80%汇合时,分别用含 Ommol/L、DMSO、50nmol/L、75nmol/L、100nmol/L、150nmol/LMG132的2%血清培养基培养24小时,收集细胞并提取蛋白进行检测:Western Blot法检测α-Syn;免疫共沉淀(CO-IP)方法检测α-Syn的泛素化情况。2.METH中毒细胞模型的建立按照上述方法培养细胞,待6孔板中细胞长至70%～80%汇合时,分别用含0mmol/L、1.0mmol/L、1.5mmol/L、2.0mmol/L、2.5mmol/L、3.0mmol/L METH的2%血清培养基培养24小时或用2.0mmol/L METH的2%血清培养基分别培养0小时、2小时、4小时、6小时、8小时、12小时、24小时。收集细胞或提取细胞总蛋白进行以下各项实验:(1)Western Blot法检测α-Syn及其磷酸化水平pS129 α-Syn、PLK2、蛋白酶体活性标志分子CD3δ、凋亡相关蛋白Caspase-3、PARP及Parkin等指标。(2)免疫荧光法检测α-Syn及Parkin表达变化,并采用共聚焦显微镜观察细胞内α-Syn及Parkin表达变化。(3)免疫共沉淀(CO-IP)方法检测α-Syn及Parkin的相互作用关系。3.METH亚急性中毒动物模型的建立根据多篇相关文献报道及本课题组前期动物模型造模方法,建立METH亚急性中毒C57小鼠模型。将20只6周龄雄性C57小鼠随机分成2组(n=10只/组):对照组(Ctrl)和METH(Subacute)给药组。METH给药组给予腹腔注射15mg/kg METH,每间隔12 h注射一次,共8次。对照组小鼠腹腔注射等量生理盐水。最后一次注射METH 2 h后麻醉、断颈、提取并分离脑组织;Western Blot方法检测α-Syn、pS129 α-Syn、PLK2、蛋白酶体活性标志分子CD3δ、凋亡相关蛋白Caspase-3、PARP及Parkin等指标表达情况。4.探究Parkin在METH诱导的α-Syn及其磷酸化异常聚集及其神经毒性的作用(1)针对Parkin基因设计并合成人源重组基因病毒,采用转染技术处理SH-SY5Y 细胞,实验分为 LV-NC 组、LV-Parkin 组、LV-NC+METH 组和LV-Parkin+METH 组。Western Blot 法检测 Parkin 蛋白过表达效率及 α-Syn、pS129α-Syn、PLK2、蛋白酶体活性标志分子CD3δ、凋亡相关蛋白Caspase-3、PARP等指标表达情况。(2)将40只6周龄雄性C57小鼠随机分成4组(n=10只/组):①空载对照组(LV-NC组);②过表达组(LV-Parkin组);③空载+ METH组(LV-NC+METH组);④过表达+ METH组(LV-Parkin+METH组)。使用前期合成并鉴定有效的鼠源Parkin基因重组病毒。利用脑立体定位注射技术向C57小鼠纹状体区注射空载病毒或Parkin基因重组病毒。注射后继续饲养二周,对③空载+METH组和④过表达+METH组给予腹腔注射15mg/kgMETH,每间隔12h注射一次,共8次。对①空载对照组和②过表达组小鼠腹腔注射等量生理盐水。最后一次注射METH2h后麻醉、断颈、提取并分离脑组织;Western Blot方法检测Parkin蛋白过表达效率及α-Syn、pS129α-Syn、PLK2、蛋白酶体活性标志分子CD3δ、凋亡相关蛋白Caspase-3、PARP等指标表达情况。结果:1.蛋白酶体抑制剂MG132处理细胞以SH-SY5Y细胞为体外实验模型,用不同浓度梯度(0nM-125nM)的泛素蛋白酶体抑制剂MG132作用于SH-SY5Y细胞24h。Western Blot结果显示,随着MG132作用浓度的增加,α-Syn表达水平呈显著上升趋势(P0.05);免疫共沉淀结果显示,α-Syn泛素化水平呈显著上升趋势(P0.05)。结果说明泛素蛋白酶体途径是α-Syn降解的主要途径之一。2.METH中毒细胞模型的建立(1)用不同浓度梯度(0mM-3.0mM)和时间梯度(0h-24h)METH作用于SH-SY5Y细胞,Western Blot结果显示,随着METH作用浓度和时间的增加,α-Syn表达水平呈上升趋势(P0.05),而E3泛素连接酶Parkin表达水平呈现下降趋势(P0.05)。α-Syn磷酸化水平pS129 α-Syn水平升高(P0.05);蛋白酶体活性标志分子CD3δ升高(P0.05),同时凋亡相关蛋白Caspase-3、PARP等表达升高(P0.05)。当METH浓度为2.0mmol/L时,α-Syn升高显著(p0.01),因此在后续试验中,选取2.0 mmol/L浓度的METH建立中毒细胞模型。以上结果说明,随着METH作用浓度和时间的增加,α-Syn磷酸化修饰增强,蛋白酶体活性降低,这可能导致α-Syn及α-Syn磷酸化蛋白不能被蛋白酶体有效降解而堆积,又进一步增强了 METH促进细胞凋亡的作用。(2)免疫荧光结果和Western Blot结果相一致,2.0mM的METH作用于SH-SY5Y细胞α-Syn表达水平呈显著上升趋势(P0.05),E3泛素连接酶Parkin表达水平呈下降趋势(p0.05)。(3)免疫共沉淀结果显示,E3泛素连接酶Parkin和α-Syn存在相互作用。3.METH亚急性中毒动物模型的建立建立C57小鼠METH亚急性中毒模型,实验分为对照组(Ctrl)和亚急性METH组(Subacute),取纹状体和中脑区进行后续实验。结果发现,亚急性METH组与对照组相比,E3泛素连接酶Parkin表达降低,α-Syn及其磷酸化水平pS129α-Syn、PLK2水平显著升高,蛋白酶体活性标志分子CD3δ呈升高趋势,且凋亡相关蛋白Caspase-3、PARP也呈现升高趋势(P0.05)。说明METH注射入C57小鼠后,会导致小鼠脑组织中α-Syn水平增加,α-Syn磷酸化作用增强,同时蛋白酶体活性降低,进一步证明METH作用降低了 α-Syn在泛素蛋白酶体途径的有效降解,增加了细胞的凋亡。4.探究Parkin在METH诱导的α-Syn异常聚集及其神经毒性的作用(1)在SH-SY5Y细胞中转染Parkin基因重组病毒再用METH处理细胞24h,实验分为 LV-NC 组、LV-Parkin 组、LV-NC+METH 组和 LV-Parkin+METH 组。Western Blot结果显示,SH-SY5Y细胞中转染Parkin基因重组病毒后,Parkin蛋白显著增多(P0.05)。LV-Parkin+METH 组和 LV-NC+METH 相比,α-Syn 表达水平明显下降,且PLK2及α-Syn磷酸化水平也明显下降,凋亡相关蛋白Caspase-3、PARP也有降低,同时蛋白酶体活性标志分子CD3δ降低(P0.05)。结果说明Parkin蛋白表达量上升能够缓解METH导致的α-Syn表达量上升,调节α-Syn磷酸化作用,激活蛋白酶体的活性,同时缓解细胞凋亡。(2)利用脑立体定位注射技术向C57小鼠纹状体区注射空载病毒或Parkin基因重组病,取纹状体和中脑区进行后续实验。Western Blot结果显示,C57小鼠纹状体区注射Parkin基因重组病后,纹状体和中脑区Parkin蛋白都显著增多(P0.05)。LV-Parkin+METH 组和 LV-NC+METH 相比,纹状体和中脑区 α-Syn表达水平明显下降,且PLK2及α-Syn磷酸化水平也明显下降,凋亡相关蛋白Caspase-3、PARP也有降低,同时蛋白酶体活性标志分子CD3δ降低(P0.05)。结果说明,在体内实验中Parkin蛋白表达量上升也能够缓解METH导致的α-Syn表达量上升,调节α-Syn磷酸化作用,激活蛋白酶体的活性,同时缓解细胞凋亡。结论:1.蛋白酶体抑制剂MG132引起SH-SY5Y细胞内α-Syn表达水平上升,且α-Syn泛素化修饰形式堆积,其上调趋势随着METH浓度的增多而升高。2.在METH中毒的体内外模型中,SH-SY5Y细胞及C57小鼠脑组织α-Syn表达量异常增多,pS129 α-Syn表达上调,PLK2水平升高,CD3δ表达升高,凋亡升高。3.在SH-SY5Y细胞中转染Parkin过表达慢病毒或在C57小鼠纹状体区注射Parkin重组病毒,α-Syn表达下降,PLK2及α-Syn磷酸化水平下降,CD3δ表达降低,凋亡降低。
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R749.64
【图文】：

图１－５免疫荧光检测ＭＥＴＨ处理的ＳＨ－ＳＹ５Ｙ细胞中Ｐａｒｋｉｎ的表达逡逑－－－

Parkin在甲基苯丙胺诱导的α-突触核蛋白异常降解中的作用机制

图１－４免疫荧光检测ＭＥＴＨ处理的ＳＨ－ＳＹ５Ｙ细胞中ａ－Ｓｙｎ的表达逡逑Ｆｉ．邋１－４邋ａ－Ｓｎｒｏｔｅｉｎ邋ｅｘｒｅｓｓｉｏｎ邋ｉｎ邋ＭＥＴＨ－ｔｒｅａｔｅｄ邋ＳＨ－ＳＹ５Ｙ邋ｃｅｌｌｓ逡逑

【参考文献】