磁免疫微流控芯片的研制及其在肺炎链球菌检测中的应用

发布时间：2020-06-20 00:48

【摘要】：研究目的:为满足临床快速诊断病原菌的需求,解决微流控芯片制作工艺繁杂等问题,本研究采用微细加工技术,以聚二甲基硅氧烷(polydimethylsioxane,PDMS)制作盖片,以玻璃制作基片,构建一种设计简单、制作方便、用于病原菌快速检测和有自主知识产权的磁免疫微流控芯片。应用于细菌性脑膜炎病原菌早期鉴别,提升我国地区不同规模医院、卫生所和疾控中心的检测能力。研究方法1.设计制作磁免疫微流控芯片和建立芯片检测系统:本研究采用计算机软件(AutoCAD 2008 Simplified Chinese)设计磁免疫微流控芯片CAD图形,以光刻机、匀胶机、PDMS混合仪和等离子清洗机等仪器制作芯片,以聚二甲基硅氧烷和玻片为主要材料构建3层结构微流控芯片。制备的磁免疫微流控芯片与注射器、进样管和出样管连接,结合微量注射泵、荧光倒置显微镜和高速摄像荧光CCD等仪器,建立磁免疫微流控芯片捕获检测系统。2.修饰免疫磁珠和优化捕获检测条件:磁免疫微流控芯片以免疫磁珠为固定相,在芯片外批量修饰磁珠,以外部磁场固定磁珠位置,结合生物素-亲和素放大作用和抗原抗体特异性反应等特点,选择最优进样速度、检测时间和荧光染料等实验参数,以最佳检测条件鉴定病原菌。3.磁免疫微流控芯片检测肺炎链球菌:以磁免疫微流控芯片为检测平台,以最佳检测条件进样捕获,以免疫荧光技术为检测方法,验证芯片可用性、捕获率、特异性、灵敏度和可重复性等参数,并模拟检测临床标本中肺炎链球菌。研究结果1.以PDMS和玻片成功构建3层结构磁免疫微流控芯片,包括检测芯片层、玻片层和磁场固定芯片层。上层检测芯片包括进样口、进样通道、检测室、出样通道和出样口;中层玻片为封接基片,和上层PDMS盖片等离子清洗后不可逆封接;下层磁场固定芯片填充磁铁,磁铁位置对应检测芯片捕获室,磁场固定芯片和玻璃基片可逆封接,方便磁场重复使用。2.设置注射泵进样速度1μL/min、5μL/min、10μL/min和15μL/min,分别注入相同浓度肺炎链球菌菌悬液,收集出样口废液,计算芯片捕获率都高于95%。3.分别检测浓度1.5×10~1 CFU/mL~1.5×10~5 CFU/mL的大肠埃希菌ATCC25922,计算芯片捕获率都为0。4.同浓度菌悬液用不同工作浓度的AO染色液和碧云天公司配制的Hoechst33342染色液避光染色1h后分别注入磁免疫微流控芯片,在倒置荧光显微镜下观察,用高速摄像CCD拍摄。结果显示AO染色液背景荧光较深,影响镜下观察检测;Hoechst 33342染色液背景荧光较弱,对镜下观察影响较小。5.磁免疫微流控芯片模拟临床肺炎链球菌检测,灵敏度达94%,特异度达100%。结论:1.本研究设计制作的磁免疫微流控芯片,已解决微流控芯片制作工艺繁杂等问题;选用商品化磁珠,不用化学修饰;无栅栏式结构,用外部磁场固定磁珠;制作芯片的过程节省时间和节约成本。2.以免疫磁珠为固定相,结合抗原抗体反应,增大反应比表面积,提高抗原抗体反应结合效率,提高芯片捕获率和分析速度,为后续研究奠定基础。3.以磁免疫微流控芯片捕获肺炎链球菌,和其他捕获方法比较,此法具有捕获率较高、操作间简单和耗时少等优点,对临床早期检测有一定帮助。4.成功设计制作磁免疫微流控芯片,相比临床实验室检测,细菌鉴定无需专业人员处理样本、接种培养和生化鉴定。能早期检测病原菌,指导临床用药,利于细菌性脑膜炎早期诊治。
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R446.5;R515.2
【图文】：

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芯片三层结构设计图

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b图 2.2 磁免疫微流控芯片的 CAD 设计图a 检测芯片的设计图，b 磁场固定芯片的设计图疫微流控芯片的制作方法磁免疫微流控芯片采用模塑制作，主要步骤如图 2.3 所示。

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