基于铅离子依赖性DNA酶构建磁控诱导电化学适体传感器及血清凝血酶的检测

发布时间：2020-06-25 04:54

【摘要】：凝血酶是一种丝氨酸蛋白酶,由凝血酶原在Xa因子作用下转化而来,将纤维蛋白原转换为纤维蛋白,在凝血级联机制中有着重要的作用。研究表明,凝血酶能够加快静脉血栓栓塞、肾病的进程以及参与中枢神经系统疾病等多种疾病的发生,其浓度的改变会导致功能的转变。因此,定量检测复杂生物样品中的凝血酶含量对临床研究和早期诊断有重要的意义。本研究结合适配体技术、纳米技术与铅离子依赖性DNA酶辅助的信号放大技术,提出了一种无酶、无标记、高灵敏度的磁控电化学适体传感器用于凝血酶的检测。本研究基于磁性生物复合材料和铅离子依赖性DNA酶,构建电化学传感平台用于凝血酶的检测。分别使用了三条核苷酸链S1、S2和S3,其中互补链S1包含巯基末端、凝血酶适配体互补序列以及铅离子(Pb~(2+))依赖性DNA酶酶切部位,S2为凝血酶适配体序列,S3是Pb~(2+)依赖性DNA酶序列。由于亚甲蓝带有正电荷,它能够通过静电作用吸附到带负电DNA上,可作为电化学信号分子。以磁性Fe_3O_4@Au纳米粒(Fe_3O_4@Au NPs)为载体,S1通过Au-S键固定在纳米粒表面,互补杂交S2,获得磁性生物复合材料Fe_3O_4@Au-S1/S2 NPs。当目标物凝血酶存在时,凝血酶竞争结合S2,从而S1上Pb~(2+)依赖性DNA酶酶切部位暴露出来,加入S3和Pb~(2+)后,S1被切割,少量的亚甲蓝被吸附到DNA链上。当凝血酶不存在时,S1/S2杂交双链不被破坏,下游反应无法继续进行,S1/S2杂交双链能吸附大量的亚甲蓝。最终,待测的纳米复合物利用磁场诱导自组装将在磁性玻碳电极表面形成磁性软膜,通过差示脉冲伏安法(Different pulse voltammetry,DPV)检测亚甲蓝的电信号变化,实现了待测物凝血酶与亚甲蓝电化学响应之间的转化与检测。本研究构建的电化学适体传感器中,适配体能够特异性识别凝血酶;Pb~(2+)依赖性DNA酶的酶切作用明显增加了Fe_3O_4@Au NPs表面核酸的变量,使得亚甲蓝的电信号变量增加了3倍,使灵敏度显著增加;磁性纳米材料的引入不仅方便磁性分离,而且可以通过磁场诱导自组装在磁性玻碳电极表面形成磁性软膜而产生测定信号,完成测定后,取出磁性电极中的磁芯,磁性软膜便可从电极表面脱落,增强了电极再生和重复使用性能,另外,利用纳米材料大的表面积达到丰富的核酸固载。该电化学适体传感器对凝血酶定量检测的线性范围为5-5000 pmol L~(-1),检测限低至1.8 pmol L~(-1),可以用于血清中凝血酶的靶向检测。
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R446.1
【图文】：

南京医科大学硕士学位论文其中互补链 S1 包含三个功能区：5'巯基末端、Pb2+依赖性 DNA 酶的底物链序列以及凝血酶适配体的互补序列，S2 为凝血酶适配体序列，S3 是 Pb2+依赖性DNA 酶序列。采用 Fe3O4@Au NPs 作为载体，可以实现实验过程中快速磁性分离和待测的纳米复合物通过磁场诱导自组装到电极表面，通过 Au-S 键将 S1 的5'端固定以获得了 Fe3O4@Au-S1 复合纳米材料。加入 MCH 溶液中，MCH 可以起到封闭剂的作用，占据 Fe3O4@Au NPs 表面剩余位点，去除 S1 的非特异性吸附。S2 与 S1 的凝血酶适配体的互补序列杂交互补，在 Fe3O4@Au NPs 表面形成双链结构（dsDNA）。

DNA 酶的底物链序列功能区，S3 无法切割 dsDNA 中的 S1。泳道 8 中 dsDNA条带比泳道 7 弱，表明在溶液中加入凝血酶后，凝血酶竞争结合 S2，完全暴露的 S1 被 S3 切割，使得 dsDNA 减少，电泳条带变浅。经电泳结果证实，目标物凝血酶介导启动 S3 的酶切作用，与预期设想一致。考察 S3 辅助的信号放大，比较反应体系在 Pb2+依赖性 DNA 酶作用前后电化学信号的变化。向磁性生物复合材料 Fe3O4@Au-S1/S2 NPs 中加入不同浓度的凝血酶溶液，相同的凝血酶浓度下，一份不加S3和Pb2+，一份加入S3和Pb2+，最终记录磁性材料表面吸附的亚甲蓝电化学信号的下降值ΔI，比较其在 S3 作用下（红色）和不加入 S3 时（黑色）ΔI 的变化。如图 2（B）所示，在加入相同浓度的凝血酶的条件下，Pb2+依赖性DNA酶作用后的ΔI比未处理的高3倍。因此，Pb2+依赖性 DNA 酶切割 S1，导致 Fe3O4@Au NPs 表面 DNA 的量明显减少，吸附的亚甲蓝减少，ΔI 成倍增加，实现了基于 S3 辅助的信号放大，提高了该方法的灵敏度。

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