三种包装病毒对杜氏肌营养不良羊水间充质干细胞感染效率的观察研究

发布时间：2020-06-26 13:27

【摘要】：背景杜氏肌营养不良(Duchenne muscular dystrophy,DMD)是常见致死性X连锁隐性遗传病。临床上DMD尚无有效治疗手段,主要是通过物理治疗、糖皮质激素治疗、矫形治疗等,但都不能延长患者寿命。DMD基因治疗是目前治疗DMD最有希望的手段之一。DMD基因治疗依赖于高效的病毒载体系统,其中腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)、腺病毒(adenovirus,AdV)、慢病毒(lentivirus,LV)等在DMD的基因治疗研究中广泛应用。然而,目前国内的病毒包装技术不成熟,病毒滴度不能达到实验要求,同时包装成本高,价格昂贵。因此,建立高效且经济的病毒包装平台能更好的促进DMD基因治疗研究在临床中的应用。目前DMD的基因治疗研究多采用患者来源的诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)作为细胞实验模型。然而iPSCs获取效率低,无法避免转染病毒带来的潜在风险。近年来,研究发现羊水来源的间充质干细胞(mesenchymal stem cells derived from amniotic fluid,AFMSC)是羊水干细胞(amniotic fluid-derived stem cells,AFSCs)的一种,其来自产前诊断标本,避免了伦理限制,没有致瘤性,为DMD基因治疗的研究提供新的干细胞来源。因此,本研究在体外建立AAV6,AdV5和LV病毒的包装体系。同时收集1例DMD患胎来源的羊水,从羊水中分离出AFMSC并完成鉴定。将包装好的AAV6,AdV5和LV病毒感染AFMSC,观察三种病毒感染AFMSC的效率,以期建立高效且经济的病毒包装平台,为后续DMD发病机制和基因治疗提供实验依据。目的1.建立AAV6,AdV5和LV病毒的包装体系。2.完成DMD患胎来源的AFMSC的分离与鉴定3.观察三种病毒感染AFMSC的效率。方法1.体外进行AdV5、AAV6和LV病毒的包装,并利用实时荧光定量核酸扩增检测系统(Real-time Quantitative PCR Detecting System,qPCR)完成病毒滴度的测定。2.收集1例DMD基因第10-15外显子发生缺失的DMD患胎来源的人羊水样本,利用直接贴壁法分离出AFMSC,通过细胞形态、染色体核型分析和流式细胞术(CD34、CD45、CD73、CD105)对AFMSC进行鉴定。3.将三种病毒感染AFMSC,比较感染的效率,评估包装后病毒的感染能力。结果1.成功完成三种病毒的体外包装。在三种病毒中,AAV6病毒、AdV5病毒和LV病毒的滴度分别为1.890×10~(13)vg/mL、1.280×10~8 vg/mL和1.252×10~(11)vg/mL。2.从DMD患胎来源的羊水样本中成功分离出AFMSC。AFMSC呈梭形或长梭形,单层生长,旋涡样排列。染色体核型分析表明AFMSC为正常核型。流式细胞术检测表明AFMSC表面标志物CD34和CD45为阴性,CD73和CD105为阳性。3.三种病毒均成功感染AFMSC。在感染效率上,AdV5病毒的感染效率最高,LV病毒其次,AAV6病毒感染效率最低。结论本实验在体外完成AdV5、AAV6和LV病毒的包装。同时也从DMD患胎来源的羊水样本中成功分离出AFMSC并完成鉴定。体外包装的三种病毒均能成功感染AFMSC,其中AdV5病毒的感染效率最高,LV病毒其次,AAV6病毒感染效率最低。
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R746.4;R450
【图文】：

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图 2 AAV6 病毒转染 HEK-293 细胞 24h、48h 和 72h 的情况（100×）A：AAV6 病毒转染HEK-293 细胞 24h 的细胞形态图；B ：AAV6 病毒转染 HEK-293 细胞 48h 的细胞形态图；C：AAV6 病毒转染 HEK-293 细胞 72h 的细胞形态图；D：AAV6 病毒转染 HEK-293 细胞24h 的荧光图；E：AAV6 病毒转染 HEK-293 细胞 48h 的荧光图；F：AAV6 病毒转染 HEK-29细胞 72h 的荧光图。

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羊水标本DMD基因MLPA检测结果

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