基于乙型肝炎病毒两表位肽段组合的ELISA检测方法研究

发布时间：2020-06-26 22:05

【摘要】：乙型肝炎是全球关注的传染病之一,是由乙型肝炎病毒(HBV)感染所致。有研究表明,HBV表面大蛋白前S1区(PreS1)在病毒感染宿主细胞过程中发挥重要作用,因此,针对PreS1的抗体检测受到广泛关注。目前特异性抗体主要采用酶联免疫吸附试验方法进行检测,但由于乙型肝炎患者群感染的HBV基因序列复杂多变,临床实际应用仍缺乏精确有效的抗体检测方法。本研究应用分子仿生学思想,以人体内多克隆抗体的抗体存在环境为仿生原型,旨在基于前期利用多基因型肽段组合包被检测患者PreS1 94 117表位抗体(P94抗体)的研究基础,通过PreS1关键表位(21 47和94 117表位)肽段的组合包被模拟PreS1全长包被,检测PreS1抗体,为后续通过多基因型多表位肽段组合模拟大样本乙型肝炎患者群中HBV的复杂基因序列状态,开发适用于大样本群抗体检测的商品化试剂盒奠定基础。本研究首先通过对中国乙型肝炎患者群的基因分型研究,创新性地建立了一种基于关键表位氨基酸序列的基因分型方法。随后通过优化肽段组合包被方式,建立了仿生肽段组合检测P94抗体的间接酶联免疫吸附法(Enzyme Linked Immunosorbent Assays,ELISA),并分别利用B和C基因型的P94肽段作为抗原,通过小鼠免疫法制备了三种针对不同基因型应答不同的单克隆抗体,作为定量化检测抗体的标准品。然后利用上述建立的ELISA方法检测了大量乙型肝炎患者血清样本中的P94抗体,对P94抗体含量与乙型肝炎患者HBV DNA载量和患病阶段进行了统计学分析。最后验证了组合包被PreS1两关键表位肽段检测抗体与包被全长蛋白检测抗体结果之间的一致性,为临床应用提供了支持。主要研究结果如下:(1)研究HBV基因分型。本文成功地对232例乙型肝炎患者进行了病毒测序分型,创新性地建立了基于氨基酸序列的基因分型方法,为利用关键表位的ELISA基因分型方法研究提供了理论依据。(2)建立并优化了P94抗体的ELISA检测方法。本文进一步优化了肽段组合检测P94抗体的包被浓度和方式,确定包被方式为B和C基因型P94肽段组合包被,其包被浓度为各5μg/mL。对单一包被B基因型、单一包被C基因型和组合包被两种基因型,这三种不同包被方式的ELISA检测方法进行分析,组合包被检测的平均变异系数显著低于单B或单C包被检测的平均变异系数,且具有较高的一致性,说明肽段组合包被的抗体检测方法重复性好且准确性高。(3)开发单克隆抗体以实现抗体检测定量化。本文制备了三种针对不同基因型应答不同的单克隆抗体,分别为对B和C基因型均应答的单抗B11、只对B基因型应答的单抗B19和只对C基因型应答的单抗C04,确定了阳性判断值,可实现P94抗体定量化检测。(4)分析了P94抗体与HBV DNA载量和患病阶段之间的相关性。本文检测了631例乙型肝炎患者血清中的P94抗体,并对乙型肝炎患者的P94抗体浓度、患病阶段以及HBV DNA载量进行了统计学分析。结果表明,当P94抗体为阳性时,P94抗体随着HBV DNA载量的升高而逐渐增加,但随着患者病情逐渐加重呈下降趋势。(5)建立了两表位肽段组合检测PreS1抗体的方法。本文对比了四种不同的包被方式(包被PreS1全长、单一包被P21表位肽段、单一包被P94表位肽段、组合包被P21和P94表位肽段)的抗体检测结果,并进行统计学分析,结果表明PreS1关键表位肽段的组合包被可有效地替代全长蛋白来实现PreS1抗体检测。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R512.62;R446.6
【图文】：

检测原理,抗体检测,表位肽

吉林大学硕士学位论文优化了 P94 抗体的 ELISA 检测体系以及基于关键表位肽段组合包被的间接ELISA 抗体检测体系，并开发了针对不同基因型应答的单克隆抗体作为标准品，以实现定量化抗体检测[49]。这种组合关键表位多肽包被的 ELISA 检测方法可以替代单一关键表位肽段或 PreS1 全长蛋白检测 PreS1 抗体，其检测灵敏度和准确性较高，并且具有可以适应临床抗体检测应用的简便性和可操作性，因此，本研究在 HBV 抗体检测和乙型肝炎防治领域具有良好的前景。

原理图,原理,杂交瘤技术,超敏反应

图 1.2 单克隆抗体制备原理术制备得到的单克隆抗体具有高亲和力、高灵敏度以广泛用于物质的检测和分离工作。但鼠源性抗体和治疗方面的应用中存在了一定的缺陷，主要因为鼠面的 Fc 段手提亲和力较差，其分泌的抗体依赖性细强，而且它与人补体成分的结合效果一般，因此与十分有限[74,75]。基因工程抗体技术制备单克隆抗体抗体技术包括很多种类型，包括嵌合抗体技术、重术、核糖体展示技术和基因工程小鼠制备抗体技术杂交瘤技术制备得到的鼠源单克隆抗体在临床治疗原（MHC）和超敏反应等问题，研究人员寻求利用

【参考文献】